谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)科研专用测试盒/可见分光光度法

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理：
GSH-Px催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。

自备仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配置：
试剂一：液体100mL×1瓶，室温保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体20μL×1支，-20℃保存。
试剂四：液体200μL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。


测定操作：
1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2. 混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min。
3. 混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一40 mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三，混匀。（注意：必须现配现用，当天使用完）
4.试剂四的稀释： 吸取21.5μL试剂四，加入5mL水充分混匀，临用前配制，配制的试剂当天使用。
5. 测定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、800μL预热的混合试剂、100μL稀释后的试剂四， 迅速混匀后于340nm处测定第30 s和第210s的吸光值，分别记为A1和A2，△A= A1﹣A2。