4-香豆酸：辅酶活性A连接酶活性检测试剂盒 | 4CL含量测

注　意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：
4CL 是连接苯途径与木质素特异合成途径的关键酶，主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶 A 酯，是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

测定原理：
4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA，在 333nm 下测 4-香豆酸 CoA 生成速率，即可反映 4CL 活性。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存；
试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪 40℃预热 30min 以上，调节波长至 333nm，蒸馏水调零。
2、 准备 96 孔 UV 板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于 340nm 务必使用 UV 板）。
3、 样本测定
（1）在试剂二中加入 5mL 试剂一充分溶解混匀，置于 40℃水浴预热 10min；现配现用（配后 24h 内用完）；
（2）对照管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂一，混匀，立即记录 333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A1。
（3）测定管：在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二，混匀，立即记录 333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。每个测定管设一个对照管。