(P5CR)测试盒_微量法

(P5CR)测试盒_微量法
测定方法：微量法
产品规格：100管/96样
储存条件：低温保存
注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：                           
脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。（P5CS， Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是以谷氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理：
催化谷氨酸生成P5C过程中分解ATP生成ADP和无机磷，通过钼酸铵比色法测定单位时间内产生无机磷的量可确定P5CS活性。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：
试剂一：液体60 mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体12 mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体12 mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存，用时加入25 mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存，用时加入25 mL蒸馏水，溶解后4℃保存一周；
试剂六：液体25mL×1瓶，室温保存；
试剂七：10mmol/L标准磷贮备液10mL×1瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七 20倍稀释，即取 0.1mL试剂七加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按H₂O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配的定磷剂应为浅。若无色则
试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。





操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm。
2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）

	对照管	测定管
试剂二（μL）		100
样本（μL）		100

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）准确水浴10min

试剂三（μL）	100	100
试剂二（μL）	100
样本（μL）	100

混匀，8000g，25℃离心10min，取上清液
3、定磷（在EP管或96孔板中加入下列试剂）

	空白管	标准管	对照管	测定管
0.5μmol/ml标准磷应用液（μL）		20
上清液（μL）			20	20
蒸馏水（μL）	20
定磷试剂（μL）	200	200	200	200

混匀，室温放置30min，在 660nm处，记录各管吸光值。

注意：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管保证测 48份P5CS活性。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
3、空白管和标准管只要做一管。每个测定管设一个对照管。