Biosharp BL671A 细胞膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂

Membrane and Cytoplasmic Protein Extraction Kit 细胞膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒 产品编号 产品名称 规格 BL671A 细胞膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒 50T BL671B 细胞膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒 100T 产品简介： 细胞膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(Membrane and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供独特的组份提 取细胞及组织中的膜蛋白和细胞浆蛋白。其原理是裂解细胞后，先离心分离出质膜粗提物，再利用多种不 同的去污剂，综合分离出膜蛋白。产物不仅含细胞膜蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜和高尔基体膜等胞 器质膜蛋白。提取方法简单，可靠，快速，膜蛋白和细胞浆蛋白得率高，可用于 PAGE 电泳、Western Blot、 免疫共沉淀、酶活性测定等后续研究。 产品组成： 注意：Lysis Buffer 与抽提 Buffer 短期（1-2 周）内使用可 4℃保存，如长期不使用需-20℃保存。 使用方法： 一．实体组织蛋白的提取 1. 组织样本（200～300mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎； 2. 组织样本中加入 1mL Lysis Buffer（注：使用前，每毫升 Lysis Buffer 加入 1µL 蛋白酶抑制剂和 1µL 1M DTT），置玻璃均浆器冰上匀浆 30~50 次，置于冰上放置 5 分钟。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞 破碎率不小于 90％； 3. 将均浆液转移至冷的离心管中，于 4℃，14000 g 离心 5min，取上清转移至新的离心管中，即为胞浆 蛋白，分装冷冻保存； 4. 取离心所得沉淀，加入 200uL 冷的抽提 Buffer，涡旋振荡混匀 30s 后，冰上放置 5min，反复 5 次； 5. 4℃，14000 g 离心 10min，取上清转移至新管，即为胞膜蛋白。Bradford 法测定蛋白含量，分装冷冻 保存。 二．培养细胞蛋白提取： 1. 收集不少于 1×107 细胞，用冷 PBS（pH7.4）洗涤细胞两次（每次 1000 g 离心 5 min）； 2. 在细胞样本中加入 1mL Lysis Buffer（注：使用前，每 mL Lysis Buffer 加入 1µL 蛋白酶抑制剂和 1µL 组分 BL671A BL671B Lysis Buffer 50mL 100mL 抽提 Buffer 50mL 100mL TCA 5mL 10mL 溶解 Buffer 15mL 30mL 蛋白酶抑制剂 50μL 100uL Loading Buffer 1mL 2×1mL DTT (1M) 50μL 100μL 1M DTT），涡旋震荡 30s，置于冰上 1min，反复 5 次。破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于 90％； 3. 4℃，14000 g 离心 10min，转移上清至新的离心管中，即为胞浆蛋白，分装冷冻保存； 4. 取沉淀，加入 200uL 冷的抽提 Buffer，涡旋振荡混匀 30s 后，冰上放置 5min，反复 5 次。 5. 4℃,14000 g 离心 10min，取上清转移至新管，即为胞膜蛋白。Bradford 法测定蛋白含量，分装冷冻保 存； 蛋白浓缩步骤——SDS PAGE 电泳前操作步骤（选做） 1. 进行 PAGE 电泳前，取该提取物，每 100µL 膜蛋白提取物，加入约 300µL 的溶解 Buffer 和约 100µL （TCA）试剂，混匀后置冰上 20～30min 后，14000 g，离心 15min，尽可能除去上清；（注） 2. 沉淀加入 1mL ，室温静置 10min 后，14000 g 离心 15min；（注） 3. 弃上清，沉淀真空旋干或置冰上干燥约 10min（敞开离心管盖），以适当的溶解液溶解后，按体积比 loading buffer：总体积=1：5 的比例，加入 Loading Buffer（使用前每 100µL Loading Buffer 加入 2～5µL 巯基乙醇） 溶解，彻底分散（枪头反复吹吸或剧烈涡旋），煮沸 5min；【注：加入 Loading Buffer 后如有部分难溶物， 可取上清继续上样；如加入 Loading Buffer 后溴酚蓝转呈黄色，此为少量 TCA 残留所致，不影响电泳结果。 请参照 Marker 标准。】 4. 上样进行 SDS PAGE 电泳。 注意：本步骤为选做步骤，主要应用于得到的膜蛋白浓度小于 0.5ug/uL 的情况。蛋白经 TCA 和沉淀 浓缩之后，再以相应的溶解液溶解。 注意事项： 1、 所有的试剂及器具均需预冷后使用。细胞或组织量需达到要求； 2、 SDS-PAGE 电泳前注意事项：如蛋白定量结果大于 1.0ug/uL，则电泳前步骤 1-2 的蛋白浓缩可以不 做，直接加入 loading buffer，煮沸变性； 3、 对于提取的蛋白质，可以采用我公司生产的 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（BL524A）或 BCA 蛋白 浓度测定试剂盒（BL521A）对提取样品中的蛋白质进行定量，优先推荐 Bradford 蛋白浓度测定试剂 盒，时间短，能有效避免蛋白降解。 4、 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放 于普通住宅内。 5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 保存条件： 4℃保存；蛋白酶抑制剂和 Loading Buffer -20℃储存；DTT(1M) -20℃避光储存；有效期一年
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