原理介绍
circRNAs(CircularRNAs,环形RNA分子)是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴,并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子,通过非经典剪接方式进行反向剪接而形成。circRNA由特殊可变剪切产生,大量存在于真核细胞的细胞质中,主要来源于外显子,少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中,表达水平具有种属、组织、时间特异性。circRNA呈闭合环状结构,不易被核酸外切酶降解,比线性RNA更加稳定,具有一定序列保守性,在转录或转录后水平发挥调控作用。绝大多数circRNA是非编码的,但也有少数可以翻译为多肽。
circRNA的作用机制有:1、作为miRNA分子的海绵(主要的),circRNA含有大量的miRNA结合位点,具有miRNA海绵作用,进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。2、作为蛋白分子的海绵,有些环状RNA上有一个或者多个RNA结合蛋白的结合位点,可作为蛋白分子的海绵体。3、引起免疫响应,有些内源性环状RNA在抗病毒反应中发挥作用,而有些环状RNA与免疫响应相关,外源性环状RNA可以通过激活模式识别受体RIG-I刺激哺乳动物细胞的免疫信号。4、编码功能,circRNA虽然属于非编码RNA,但是也有少数circRNA可以编码多肽,通过编码多肽行使调控功能。
图1.circRNA的生物发生(Kristensen LS,et al.Nat Rev Genet.2019.)
AAV介导circRNA过表达应用实例(Meganck RM, et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2021.)
C57BL/6小鼠尾静脉注射(3×1011vg/每只)AAV9-CMV-HIPK3 Polio(HIPK3内含子+脊髓灰质炎病毒IRES+GFP外显子)及AAV9-CMV-HIPK3 Polio△△(L△R△内含子+脊髓灰质炎病毒IRES+GFP外显子),4周后取材切片观察,结果显示均可在心脏、肝脏及肌肉中过表达,且L△R△内含子对的circRNA表达效果更好。
图2. L△R△内含子对可增加小鼠体内多个组织中的circRNA表达
我司提供AAV/Lentivirus介导circRNA过表达及干扰服务
服务说明
我司提供pAAV-ciR、pLV-ciR等circRNA过表达载体构建服务,同时可选择携带各种荧光报告基因或抗性基因,适用于普通真核表达、慢病毒包装与稳转细胞系建立、腺相关病毒包装等多种用途。该系列载体均含有circRNA环化表达框架,用于克隆目标circRNA的线性序列,之后转染细胞后可通过RNA剪切形成circRNA分子。
我司针对circRNA的接头序列设计多条siRNA序列,筛选特异性高效干扰目的circRNA表达的siRNA,构建shRNA病毒载体并包装所需病毒。也可直接转染或通过包装慢病毒感染细胞筛选circRNA特异性敲低稳定细胞株。
过表达服务流程
1、客户提交circRNA资料(ID号或者序列)、构建要求;
2、circRNA过表达载体构建;
3、载体验证(根据客户选择,默认提供293细胞转染验证环化效果);
4、病毒包装;
5、稳定细胞株构建(根据客户需要选择,需要客户提供目标细胞)。
需客户提供内容/材料
1:过表达的目的基因模板(质粒/菌液)或基因序列(基因ID);
2:病毒类型选择以及要求;
3:血清型选择。
最终交付
1:载体构建报告;
2:合同约定的rAAV/慢病毒的滴度和病毒量;
3:质检报告;
4:测序文件;
5:过表达质粒/病毒/稳定细胞系。
RNA干扰服务流程
1、客户提交circRNA资料(ID号或者序列)、构建要求;
2、设计多条siRNA,筛选高效率干扰siRNA;
3、设计circRNA特异性引物,检测敲低circRNA的效率;
4、构建shRNA载体,干扰慢病毒或腺相关病毒包装;
5、稳定细胞株构建(可选,需要客户提供目标细胞)。
注:过表达筛选保证3条里面有1条干扰效率达到70%以上。
表1.服务内容及周期
实验名称 |
服务内容 |
周期(工作日) |
备注 |
circRNA siRNA筛选 |
siRNA设计和合成 |
15 |
1条阴性对照、3条siRNA |
细胞转染(客户提供细胞) |
PCR干扰效率验证 |
circRNA shRNA载体构建 |
载体构建 |
15-20 |
1.一条shRNA质粒;2.对照shRNA质粒;3.干扰验证报告 |
细胞转染(客户提供细胞) |
PCR干扰效率验证 |
病毒包装 |
干扰慢病毒或腺相关病毒 |
10-15 |
干扰病毒液、对照病毒液 |
稳定细胞株构建检测(可选) |
circRNA稳定细胞株筛选(客户提供细胞) |
20-25 |
病毒感染后筛选,检测干扰效率 |