拟南芥原生质体制备及转化试剂盒（10 mL/T）

拟南芥原生质体制备及转化试剂盒（10 mL/T）

储存条件：A 盒，-20℃储存；B 盒，常温储存。 

产品组成：

产品简介：

本试剂盒主要通过纤维素酶和离析酶配制的酶解液消化植物细胞壁获得原生质体。适用于短日照培养的拟南芥植株或者在培养皿生长的拟南芥幼苗中分离原生质体。获得的细胞可用于蛋白的亚细胞定位，验证蛋白间的相互作用，研究蛋白的转录调控等。本试剂盒包含原生质体制备和转化需要的全部试剂，按照每次 10 mL 酶解液的使用量，可供 20 次实验 。

使用说明：

一、准备工作

1. 需要准备的材料（本试剂盒不提供）：

锋利刀片；血球计数板；50 mL 离心管；2 mL 离心管，65℃ 水浴。

2. 即用型酶解液配制

二、 原生质体的分离制备

1.水稻种子经消毒后接种到 1/2MS 培养基上，在光照或黑暗条件下生长 7-14 天。

2.用锋利的刀片去除水稻的根和种皮，尽可能保留基部的分生组织。每次切 4-5 株幼苗，将叶片横向（平行主叶脉）切成 0.5-1.0 mm 宽的的细条（去掉主叶脉）。

注：切叶片时可以将 3-5 片叶叠在一起，不要过多，避免拖拽，以防破坏原生质体。

3.切好的水稻细条放入装有 20 mL 酶液的小烧杯中，锡箔纸包裹，烧杯口留洞，抽真空 10 分钟（15Hg/50kpa/0.5）。

4.避光室温 40-50 rpm 摇床上摇动 4h。收集原生质体前，温柔摇晃小烧杯，让细胞完全释放出来（肉眼可见器皿中有浓绿色溶液浸出）。

注：黄化苗酶解后原生质体不呈绿色，酶解完成后，可以取一滴酶解液镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，继续往下做；如果细胞扁且发黑，则弃去。

5.酶解后的产物用细胞筛过滤，用镊子或无菌枪头轻轻夹取酶解物帮助充分释放原生质体， 去除未消化的叶片组织。用 10 mL 溶液 II-W5 solution 冲洗酶解器皿和未消化的叶片 2-3 次， 将所有的液体收到 50 mL 离心管中。

注：操作过程中尽可能动作要轻柔，避免剧烈震荡，防止原生质体破碎。

6.选用水平转头，150 g 离心 2 min，升速 3，降速 3，去除上清。

注：离心时，可调低离心机的升速和降速。升速过快，原生质体可能离到管壁上；降速过快，可能导致管底原生质体悬起。建议升速和降速分别都使用 3。

7.用 10 mL 遇冷的溶液 II-W5 solution 温柔重悬位于底部的原生质体，用剪尖的蓝枪头轻轻将原生质体悬起，150 g 离心 2 min，升速 3，降速 3，去上清。

8.加入 1 mL 遇冷的溶液 II-W5 solution，重悬原生质体，冰上静置 30 min。

9.在离心前，可以显微镜下观察原生质体的状态和血球计数板计数。

注：如原生质体呈现圆球形，叶绿体分散在整个细胞内，说明状态较好；如呈现不规则形状，说明原生质体破碎或即将破碎。

血球计数板的使用：

如下图所示，在血球计数板上加上一个盖玻片，分别从两侧凹槽加入样品。使用中央区域长和宽都是 1 mm 的方形区域进行计数（25 个中方格）。分别统计正方形四个顶角和中央的小正方形的细胞数量，取 平均值再乘以 25（正方形被分成了 25 个小正方形），计算该区域的细胞数量，该区域的体积为 0.1 µL（长 1 mm，宽 1 mm，高 0.1 mm）。计算获得的细胞数量。原生质体浓度（个/mL）=25 个中方格原生质体数 ×10⁴×稀释倍数。

10.100 g 离心 1 min，升速 3，降速 3，去上清，用相应体积的 MMg 溶液重悬原生质体，调整原生质体密度为 2×10⁵个/mL。（如细胞量较少，可以将所有细胞用于 1-2 个转化体系）

三、 原生质体的转化 

1. 在 2 ml 的圆底离心管中加入 10 µL（10-20 µg）纯化后的质粒，随后加入 100 µL 已调整好 浓度的原生质体，轻轻混匀，再加入 110 µL 溶液 IV-PEG solution（65℃水浴完全溶解后使用） 旋转离心管，或使用剪尖蓝枪头（1ml 吸头）轻轻吸打，直至混匀，此过程中避免产生气泡， 28℃放置 3-30 min。（常规实验约需 15min，间歇轻柔混匀）

注：溶液 IV-PEG solution 含低浓度甘露醇，满足正常转化需求。初次实验默认使用常规的溶液 IV-PEG solution 进行转化。PEG solution 较难溶解，需 65℃水浴完全溶解后使用。

赠品 PEG solution(高浓度甘露醇)，含高浓度甘露醇，用于备选转化条件。如转化效率欠佳，可以考虑分别使用两种 PEG solution 进行转化，选择转化效率高的转化液进行转化。

2. 加入 1.6 mL 溶液 II-W5 solution，轻柔混匀，终止转化。常温 150 g 离心 2 min，升速 3，降速 3，在不损失原生质体的情况下，尽可能去掉上清。

3. 加入 2 mL 溶液 II-W5 solution 悬浮原生质体，常温 150 g 离心 2 min，升速 3，降速 3，去上清。

四、原生质体的培养和收集：

1. 加入 2 mL 溶液 II-W5 solution 悬浮细胞。将离心管水平放置于光照培养箱中（28℃），避免强光照，孵育 16 h。

2. 收集细胞时，缓慢将离心管拿起，用枪头轻柔的将附着在管壁上的细胞悬起，离心管室温垂直静置几分钟后再离心，150 g 离心 2 min，升速 3，降速 3，去除大部分溶液 II-W5 solution，收集原生质体，用于后续实验。

注意事项：

1.分离制备的原生质体没有细胞壁的保护，非常脆弱，整个实验操作过程中动作尽可能的轻柔。

2. 为了避免原生质体离心时贴在管壁，建议整个实验过程使用平角转头。

3. 实验过程中尽可能使用剪尖蓝枪头（1ml 吸头），因为其尖端的孔径较大；或把黄色枪头的尖端剪掉，并保证平滑。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！