m6A RNA甲基化测序

m6A RNA甲基化测序 | RNA 甲基化研究工具

 

m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA内部序列中最常见的一种甲基化修饰，同时可以功能性的调节真核生物的转录组从而影响mRNA的剪接、出核、定位、翻译和稳定。m6A RNA出现在多种重要的细胞生命过程中，意味着mRNA甲基化参与了多种生物学过程，如干细胞分化、生物节律等，同时也参与了多种疾病的发生，包括肿瘤、肥胖和不育等。

 

技术优势

 

目前对m6A的转录组研究方法为MeRIP-seq（mRNA甲基化测序）的方法，其原理是通过m6A特异性抗体对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段进行高通量测序。结合生物信息学分析，即可在转录组范围内对m6A修饰进行系统研究。

• 灵活度高：能够直接对任意物种的转录组高甲基化片段进行测序，无需已知的基因组序列信息。
• 检测范围广：覆盖整个转录组范围的甲基化区域。
• 精确度高：能够在实际结合位点100-200个碱基范围内精确定位。
• 数字化信号：直接对甲基化片段进行定量和测序，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。

 

科学方案设计

Hi-C 三维基因组方案设计

近两年，科学家们首次发现了一种可逆性的RNA甲基化—m6A。随后，研究人员陆续定位了哺乳动物转录组中的m6A，鉴定了这种动态修饰所需的“读”、“写”和“擦除”蛋白，解析了m6A在转录后调控中的一些功能。由此，RNA甲基化（m6A）研究在表观遗传领域开始崭露头角，成为最前沿的热点！N6-甲基腺嘌呤(m6A）是真核生物最常见和最丰富的RNA分子修饰。m6A修饰是METTL3甲基转移酶复合体催化的，而最近新发现的RNA去甲基化酶FTO 和ALKBH5 可以通过一种α-酮戊二酸和Fe2+依赖型的形式对m6A去甲基化。 METTL3， FTO和 ALKBH5被证明在很多生物过程中起重要作用，从发育和代谢到生殖。m6A存在于很多物种质中，占到了RNA碱基甲基化修饰的80%。m6A主要分布在mRNA中，也出现在非编码RNA如tRNA， rRNA和snRNA。在转录成的RNA中相对高的m6A含量会影响RNA的代谢过程，比如剪切，核转运，翻译能力和稳定性，以及RNA转录。

 

详尽的RNA甲基化研究方案

 

RNA 甲基化指发生在RNA 分子上不同位置的甲基化修饰现象，常见的RNA转录后修饰方式有6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C)等。

新研究发现，m6A修饰在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。因此meRIP-seq助力解决细胞分化，生物发育、疾病发生发展，热休克反应等生物学问题。

利用甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序 (Methylated RNA Immunoprecipitation sequening，MeRIP-seq)技术，可以对RNA转录后甲基化修饰图谱进行全面研究，是表观转录组学研究的关键技术。

m6A甲基化调控机制

 

m6A作为真核细胞丰度最高的mRNA修饰，已发现在许多正常生物过程中发挥重要的作用，如组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答等。m6A修饰机制在正常生物过程中如此重要，与癌症的发生、发展和药物应答的关系也十分密切。


 

FTO与白血病和脑癌

 

为了研究FTO对肿瘤的病理作用，研究者分析了几组急性髓细胞白血病(AML)患者大样本的全基因组基因表达数据，发现FTO在AML的某些特定亚型中高表达，包括t(11q23)/MLL-重组、t(15;17)/PML-RARA、FLT3-ITD或NPM1突变。

在体内和体外的功能获得性、缺失性实验中，他们发现FTO表达的增加，使人AML细胞存活率、增殖能力提高，促进正常造血干/祖细胞(HSPC)的癌化，并抑制ATRA诱导的AML细胞分化。重要的是，研究者发现FTO，是作为一个m6A去甲基化酶(demethylase)发挥这个作用的，它能在转录后调控它的关键靶RNA表达。

研究者还进行了全转录组m6A-seq、荧光素酶报告基因和突变实验、mRNA稳定性实验和基因特异m6A-qPCR实验，结果表明FTO通过降低m6A修饰丰度、从而降低靶mRNA转录本的稳定性，负调控ASB2和RARA表达。



 

ALKBH5与脑癌和乳腺癌

 

该研究发现，ALKBH5的表达在胶质瘤干细胞样细胞(GSCs)中异常上调，这种高表达与GBM患者的不良预后相关。细胞和体内实验表明，沉默ALKBH5能降低GSC细胞的自我更新能力且抑制GSC增殖/抑制肿瘤生长。随后，研究者利用meRIP鉴定m6A RNA甲基化修饰模式，联合基因芯片检测差异表达＞2倍的基因，最终筛选到与胶质瘤增殖相关的转录因子FOXM1，是ALKBH5的靶基因；再通过qPCR、WB、免疫荧光、核质分离WB/qPCR、RIP和MeRIP等实验证明ALKBH5使FOXM1转录本去甲基化，增加FOXM1表达；此外，FOXM1反义lncRNA(FOXM1-AS)还能促进FOXM1与ALKBH5的相互作用。

 

METTL3/14与正常和恶性造血作用

 

研究者发现METTL14在HSPC细胞以及携带有t(11q23)、t(15;17)或者t(8;21)的AML细胞中高表达，而在髓系分化的过程中下调，敲除METTL14则会促进正常的HSPC和AML细胞终末髓系分化，并且能够抑制AML细胞的存活/增殖。在机制上，METTL14通过m6A修饰调节其靶基因（如：MYB，MYC）发挥致癌作用，并在蛋白质水平受SPI1的负调控。METTL14在AML疾病以及白血病干/起始细胞（leukemia stem/initiation cells，LSCs/LICs）的发展以及维持过程中必不可少。总之，该研究揭示了SPI1-METTL14-MYB/MYC信号轴在髓细胞和白血病中的作用，并强调了METTL14调控m6A修饰在正常和恶性造血中的关键作用。




项目流程


利用甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序 (Methylated RNA Immunoprecipitation sequening，MeRIP-seq)技术，可以对RNA转录后甲基化修饰图谱进行全面研究，是表观转录组学研究的关键技术。 甲基化RNA免疫共沉淀 (Methylated RNA Immunoprecipitation，MeRIP) 基于抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础，然后通过高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域，高效获得结果。利用甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序 (Methylated RNA Immunoprecipitation sequening，MeRIP-seq)技术，可以对RNA转录后甲基化修饰图谱进行全面研究，是表观转录组学研究的关键技术。 甲基化RNA免疫共沉淀 (Methylated RNA Immunoprecipitation，MeRIP) 基于抗体特异性结合甲基化修饰的碱基的原理，以RNA免疫共沉淀富集甲基化修饰片段为基础，然后通过高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA区域，高效获得结果。

 

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