
多重免疫荧光组化技术服务
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- 原理介绍: 酪酰胺信号放大(TSA,Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法,类似常规免疫组化的DAB显色方法 ,TSA技术同样采用HRP标记的二抗,同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物,产生活化荧光底物,活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合,使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物,重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育,换另一种酪胺荧光素底物,如此往复就可实现多重标记。
- 上海
- 2025年07月15日
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- 提供商:
上海古朵生物
- 服务名称:
多重免疫荧光组化技术服务
- 规格:
张
多重荧光免疫组化--TSA 技术
基于酪胺信号放大(TSA)技术 ,多重荧光免疫组化( mIHC)利用抗原抗体反应对样 本中多种蛋白标志物进行染色标记 ,实现在同一组织切片上多个靶标蛋白共同染色(最 多可实现数十种蛋白的共染色),从而通过荧光图像分析挖掘组织微环境中的复杂信息 , 如定量分析、共表达确定细胞分型、空间关系分析等等。




一、技术原理
酪酰胺信号放大(TSA ,Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶 ( HRP)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。荧光标记的酪胺分子在 H2O2 环境下被二抗标记的 HRP 催化激活 ,产生大量的酶促反应 ,使荧光素在抗原- 抗体结合部位与组织周围的蛋白残基结合 ,形成大量的荧光素沉积 ,实现信号放大。
TSA 技术原理是荧光染料与抗原直接结合 ,通过热处理或微波处理可洗脱一抗和二抗并 同时保留与组织抗原共价结合的荧光素。因此可以通过使用不同的偶联染料多次循环实 验对多种蛋白抗原进行荧光标记 ,实现一张组织切片上多个蛋白的共染色。

二、优势
①TSA 技术可使荧光放大信号大幅增强 ,大约是普通荧光的 3~10 倍。
②一抗抗体的种属来源不限。
普通荧光免疫组化共染的不同靶标要求一抗抗体是不同的种属来源 ,而 TSA 技术每一 轮染色后可以把上一轮的一抗和二抗洗掉 ,对后一轮染色无影响 ,因此同一种属来源的 一抗并不影响实验结果。
③实验过程中无需严格避光 ,因荧光素稳定不容易淬灭 ,实验操作过程中即使没有避光 也不影响实验结果 ,且染色后的玻片可以保存数月不淬灭 ,仍可以重新扫描。
三、实验步骤
1.脱蜡和水化
将切片组织依次放入烘箱内烤片 1h →二甲苯 Ⅰ15min → 二甲苯Ⅱ15min →无水乙醇 Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ
2.抗原修复
根据一抗选择合适的修复液(酸性的柠檬酸钠缓冲液或碱性的 Tris-EDTA 缓冲液),将 切片组织浸没于修复液中加热至沸腾 ,中低火维持 20 min, 自然冷却至室温。
用 PBS 洗涤三次 ,每次 4 min。切片组织放入 3%过氧化氢水溶液中 ,孵育 15 min。 用 PBS 洗涤三次 ,每次 4 min。
4.封闭
在组织周围画阻水圈(防止抗体流走),在圈内加入血清封闭 10min。
5.一抗孵育
轻轻甩去封闭液 ,在圈内滴加一抗工作液覆盖组织 ,于湿盒内 4℃孵育过夜或者 37℃ 1~2h。
6.二抗孵育
用 PBS 洗涤三次 ,每次 4 min。圈内加入配置好的 HRP 标记二抗(与一抗相应种属), 避光室温孵育 30min。
7. TSA 荧光染料反应
用 PBS 洗涤三次 ,每次 4 min。圈内滴加 TSA 工作液孵育 10min。PBS 洗涤三次,每 次 4 min。
8、重复 2-7 步骤(选择对应的 TSA 荧光染料)
9、DAPI 细胞核染色
PBS 洗涤三次 ,每次 4 min。圈内滴加 DAPI 抗淬灭染液孵育 10min。
10、 封片
PBS 洗涤三次 ,每次 4 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
11、使用荧光扫描仪对玻片组织进行全景扫描 ,扫描图片可永久保存。

四、注意事项
①染料充分溶解混匀 ,有的试剂盒是有机溶性 ,如有沉淀 ,一定要先过滤。
②实验过程中避免切片干燥 ,并注意避免强光照射。
③选择特异性高的一抗抗体 ,优先单克隆。
④表达高的一抗搭配弱光 ,表达低的搭配强光。
⑤实验前做好方案设计 ,确定好染色顺序、修复条件 ,以及每个抗体搭配的荧光染料。
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文献和实验文 章 引 用 试 剂 盒 / 方 法 :
Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit Guduo Biological Technology, shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.
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