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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
大量
- 英文名：
ProteOrange Protein Quantification Kit
- CAS号：
/
- 保质期：
保质期12个月
- 供应商：
齐源生物
- 保存条件：
储存在 +4 °C
- 规格：
500 uL dye
ProteOrange 蛋白质定量试剂盒详细如下：
带有荧光染料的 ProteOrange 试剂盒允许以比分光光度法和其他用于蛋白质定量的常规方法（Lowry，Bradford，BCA）更高的灵敏度进行蛋白质定量。
ProteOrange 试剂是试剂盒的关键成分，其游离形式几乎没有荧光。在溶液中，它与蛋白质分子形成复合物，并在与蛋白质结合时表现出增加的荧光。ProteOrange 在与蛋白质的复合物中的激发最大值在 ~485 nm，发射最大值在 ~590 nm。该试剂盒可与任何具有合适激发源和检测通道的荧光计一起使用。一般来说，所测蛋白质浓度的工作范围受设备灵敏度的限制。对于比色皿荧光计，推荐的可测量浓度范围为 10 ng/mL 至 10 µg/mL，对于平板荧光计，推荐浓度范围为 100 ng/mL 至 10 µg/mL。
该试剂盒包含 ProteOrange 荧光染料、用于制备染料工作溶液的缓冲液和蛋白质浓度标准品（BSA，2 mg/mL）。为了量化测试蛋白质，制备染料工作溶液并用它来稀释测试样品和已知蛋白质浓度的样品以生成校准曲线。使用来自试剂盒的牛血清白蛋白或（如果有）与测试样品中相同的实验蛋白质制备蛋白质浓度标准。在 95°C 下孵育准备好的样品 10 分钟以使蛋白质变性，让它们冷却至室温并测量荧光强度。
根据样品体积，测量次数从 200（标准荧光比色皿的样品体积 2.5 mL 和分析体积 2 mL）到 2000（96 孔板的样品体积 250 µL 和分析体积 200 µL）不等。
该协议适用于试剂盒与平板荧光计一起使用且检测体积为 200 µL（96 孔板）的情况。如果使用具有其他检测体积的荧光计（例如，对于标准荧光比色皿，检测体积为 2 mL 的比色皿荧光计），请相应地重新计算所有体积。
该试剂盒的方案包括将样品在 90 至 95 °C 加热 10 分钟，以使测试样品中的蛋白质变性和荧光信号稳定。下面的协议规定蛋白质标准品和测试样品应在单独的试管中制备，然后加热并转移到板上以测量荧光。如果有相关设备，您可以在板上制备蛋白质标准品和测试样品，用耐高温的盖子或薄膜将板盖紧以防止蒸发，然后按照协议加热样品。当样品冷却至室温时，通过离心丢弃冷凝液并按照协议进行。
如果测试样品的预期浓度在已知的较窄范围内，您可以制备一种 BSA 储备溶液和相应的 BSA 标准品，使校准曲线涵盖测试蛋白质浓度的预期范围。例如，如果测试样品的预期浓度为 2 到 10 µg/mL，您应该只制备一种 BSA 储备溶液 (10 µg/mL)（参见第 3.1 项），然后从中制备浓度为 0、10 的 BSA 标准品, 8, 4 和 2 µg/mL（根据表格，见第 3.2 项）在荧光计上进行测量。
ProteOrange 对 BSA 复合物的荧光强度与 BSA 浓度的关系。BSA 浓度为 100 ng/mL 至 10 µg/mL。使用平板荧光计进行荧光测量，用于激发和检测的滤光片分别为 485/10 和 575/20 nm。
带有荧光染料的 ProteOrange 试剂盒允许以比分光光度法和其他用于蛋白质定量的常规方法（Lowry，Bradford，BCA）更高的灵敏度进行蛋白质定量。
ProteOrange 试剂是试剂盒的关键成分，其游离形式几乎没有荧光。在溶液中，它与蛋白质分子形成复合物，并在与蛋白质结合时表现出增加的荧光。ProteOrange 在与蛋白质的复合物中的激发最大值在 ~485 nm，发射最大值在 ~590 nm。该试剂盒可与任何具有合适激发源和检测通道的荧光计一起使用。一般来说，所测蛋白质浓度的工作范围受设备灵敏度的限制。对于比色皿荧光计，推荐的可测量浓度范围为 10 ng/mL 至 10 µg/mL，对于平板荧光计，推荐浓度范围为 100 ng/mL 至 10 µg/mL。
该试剂盒包含 ProteOrange 荧光染料、用于制备染料工作溶液的缓冲液和蛋白质浓度标准品（BSA，2 mg/mL）。为了量化测试蛋白质，制备染料工作溶液并用它来稀释测试样品和已知蛋白质浓度的样品以生成校准曲线。使用来自试剂盒的牛血清白蛋白或（如果有）与测试样品中相同的实验蛋白质制备蛋白质浓度标准。在 95°C 下孵育准备好的样品 10 分钟以使蛋白质变性，让它们冷却至室温并测量荧光强度。
根据样品体积，测量次数从 200（标准荧光比色皿的样品体积 2.5 mL 和分析体积 2 mL）到 2000（96 孔板的样品体积 250 µL 和分析体积 200 µL）不等。
该协议适用于试剂盒与平板荧光计一起使用且检测体积为 200 µL（96 孔板）的情况。如果使用具有其他检测体积的荧光计（例如，对于标准荧光比色皿，检测体积为 2 mL 的比色皿荧光计），请相应地重新计算所有体积。
该试剂盒的方案包括将样品在 90 至 95 °C 加热 10 分钟，以使测试样品中的蛋白质变性和荧光信号稳定。下面的协议规定蛋白质标准品和测试样品应在单独的试管中制备，然后加热并转移到板上以测量荧光。如果有相关设备，您可以在板上制备蛋白质标准品和测试样品，用耐高温的盖子或薄膜将板盖紧以防止蒸发，然后按照协议加热样品。当样品冷却至室温时，通过离心丢弃冷凝液并按照协议进行。
- 制备 1× ProteOrange 缓冲液。
根据样品体积和测试样品量（见第 4 项）和蛋白质标准品（见第 3 项）准备足量的 1× ProteOrange 缓冲液。要制备 1× 缓冲液，用去离子水 将 10× ProteOrange 缓冲浓缩液稀释 10 倍。
- ProteOrange 染料工作溶液的制备。
准备ProteOrange 染料工作溶液。为此，用1× ProteOrange 缓冲液将 500× ProteOrange 浓缩试剂稀释 500 倍。例如，要量化 3 个样品（参见项目 4，示例 #1）和 10 个标准品（参见项目 3），您应该准备约 4 mL 的 1× ProteOrange 缓冲液和 4 mL 染料工作溶液（混合 8 µL ProteOrange用 4 mL 的 1× ProteOrange 缓冲液浓缩试剂）。！染料工作溶液应在制备后数小时内使用。在延迟测量的情况下，保护准备好的染料工作溶液免受光照。！仅在塑料容器中制备染料工作溶液。染料会吸附到玻璃表面，导致样品中染料浓度降低，测量结果出现偏差。
- 蛋白质标准品的制备。
需要蛋白质浓度标准来生成校准曲线，用于将测试样品的荧光强度转换为其蛋白质浓度。校准曲线考虑了使用不同荧光计时的结果可变性，使用相同荧光计的不同实验运行之间，以及染料工作溶液制备过程中的移液误差。因此，建议为每次新的实验运行生成校准曲线；但是，如果实验条件保持不变，您可以使用之前实验中生成的校准曲线。要生成校准曲线，最好使用将在测试样本中量化的相同蛋白质。如果不能使用相同的蛋白质，请使用试剂盒中的蛋白质浓度参考标准（即 BSA 溶液 2 mg/mL）。该试剂盒可测量的浓度范围为比色皿荧光计为 10 ng/mL 至 10 µg/mL，平板荧光计为 100 ng/mL 至 10 µg/mL。根据测试样品中预期的蛋白质浓度和使用的荧光计，您可以为试剂盒的整个工作范围或部分生成校准曲线。请参阅下文，了解针对平板荧光计（100 ng/mL 至 10 µg/mL）和 200 µL 测定体积（96 孔板）的整个工作范围内的 BSA 浓度标准的制备程序：
- 3.1。使用试剂盒中的蛋白质标准品 BSA 2 mg/mL，在单独的 1.5 mL 管中在 ProteOrange 染料工作溶液中制备 10 µg/mL 和 1 µg/mL 的 BSA 储备溶液。
- 10 µg/mL：5 µL 蛋白质标准品、2 mg/mL TE 缓冲液中的 BSA + 995 µL ProteOrange 染料工作溶液
- 1 µg/mL：100 µL BSA 储备溶液 10 µg/mL + 900 µL ProteOrange 染料工作溶液
- 3.2. 根据下表，在单个 1.5 mL 管中使用准备好的 BSA 储备溶液制备 BSA 标准品：
- 3.1。使用试剂盒中的蛋白质标准品 BSA 2 mg/mL，在单独的 1.5 mL 管中在 ProteOrange 染料工作溶液中制备 10 µg/mL 和 1 µg/mL 的 BSA 储备溶液。
| BSA 原液* | BSA 储备溶液的体积，µL | ProteOrange 染料工作溶液的体积，µL | 最终 BSA 浓度，μg/mL |
|---|---|---|---|
| 0 | 250 | 0 | |
| 10 微克/毫升 | 250 | 0 | 10 |
| 200 | 50 | 8 | |
| 100 | 150 | 4 | |
| 50 | 200 | 2 | |
| 1微克/毫升 | 250 | 0 | 1 |
| 200 | 50 | 0.8 | |
| 100 | 150 | 0.4 | |
| 50 | 200 | 0.2 | |
| 25 | 225 | 0.1 | |
| * ProteOrange 染料工作溶液中第 3.1 项中制备的储备溶液 | |||
- 测试样品的制备
在单个试管中用 ProteOrange 染料工作溶液稀释蛋白质样品。我们建议将初始蛋白质样品稀释 20 倍以上，以使最终样品中初始样品的体积不超过 5%。这是由于与样品中的蛋白质结合的染料量和初始样品中污染物的最高稀释度造成的，这抵消了它们对结果的影响。示例 #1：要制备一个体积为 200 μL 的样品，混合 5 μL 初始蛋白质样品和 195 μL ProteOrange 染料工作溶液（1:40 稀释）。示例 #2（对于初始蛋白质样品中的高浓度污染物）：使用 ProteOrange 染料工作溶液制备初始蛋白质样品的两个连续稀释液：
- 20 倍稀释：将 13 μL 初始蛋白质样品与 247 μL ProteOrange 染料工作溶液混合。
- 100 倍稀释：将 50 微升 20 倍稀释样品与 200 微升 ProteOrange 染料工作溶液混合。
！请注意，校准曲线应涵盖测试样品所有稀释度的浓度，试剂盒的工作范围为比色皿荧光计的 10 ng/mL 至 10 µg/mL 和平板荧光计的 100 ng/mL 至 10 µg/mL。但是，在稀释初始样品时避免使用太小的体积，因为移取小体积时的不准确性会影响测量结果。 - 在黑暗中在 90 至 95 °C 下孵育所有试管（带有蛋白质标准和测试样品）10 分钟。
- 让所有试管的内容物冷却至室温（约 15 至 20 分钟），不要将它们暴露在光线下。
- 通过离心丢弃冷凝液。
- 将 200 μL 等分试样和蛋白质标准品加载到 96 孔板孔中。
- 荧光测量。
使用合适的激发光源和检测通道：蛋白质复合物中的 ProteOrange 试剂在 ~485 nm 处具有最大吸收，在 ~590 nm 处具有最大发射。
- 使用蛋白质标准的荧光强度值生成校准曲线。使用多项式近似，确定蛋白质浓度 (µg/mL) 与荧光强度 (RFU) 的方程，并计算测试样品中的蛋白质浓度。
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文献和实验相关实验
发光基团pNA游离出来，可通过酶标仪或分光光度计（λ=405nm 或400nm）测定其吸光值，通过测定吸光度来检测Caspase的活性。 二、自备试剂 PBS、蛋白定量试剂盒(Bradford法,选用) 三、实验操作指南 1．准备工作： A、 裂解液溶解后混匀，冰浴备用。 B、 裂解液工作液制备：每50 μL裂解液中加入0.5 μL DTT，冰浴备用。 2．样本处理： A、悬浮细胞 1） 诱导完成后的细胞，2000 rpm离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS轻轻重悬细胞并计数
Active Motif公司是一家致力于细胞生物学和分子生物学研究用试剂的开发和生产的专业公司，是世界上著名的转录因子试剂生产商。其细胞生物学产品涉及：蛋白质转染试剂、一氧化氮定量试剂盒、转录因子ELISA试剂盒、细胞核提取试剂盒、染色试剂、细胞提取物、抗体等；分子生物学产品涉及：mRNA和总RNA的提取、E.coli表达系统、蛋白纯化系统、基因快速富集系统、DNA分离纯化系统、cDNA合成、RT-PCR试剂盒以及其他辅助试剂。
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