LumiPure DNA 凝胶提取试剂盒

LumiPure DNA 凝胶提取试剂盒设计用于从琼脂糖凝胶或酶促反应中快速有效地纯化 DNA 片段。从琼脂糖凝胶上切下感兴趣的 DNA 片段并置于微量离心管中。凝胶溶解缓冲液溶解琼脂糖凝胶切片，使蛋白质变性，并确保 DNA 选择性结合到柱中的膜上。它还包含一个颜色 pH 指示剂，可以轻松控制最佳 pH 值。如果 pH 值向碱性侧移动，则添加中和缓冲液会返回 DNA 与柱膜结合的最佳 pH 值。在接下来的步骤中，对含有 DNA 的柱膜进行一系列洗涤。洗涤液的特殊配方可以完全去除柱膜上的杂质。最后，

套件规格：

• 样品：凝胶切片或含有目标 DNA 的酶促反应（大小从 70 bp 到 10 kb）
• 操作时间：20分钟
• 柱结合能力：5 或 20 µg DNA
• 洗脱体积：≥ 10 或 25 µL
• 典型的 DNA 回收率：琼脂糖凝胶回收率不低于 50%，酶反应回收率不低于 75%
• DNA 纯度：OD ₂₆₀ /OD ₂₈₀ >1.8

纯化后的 DNA 适用于任何后续应用，例如 PCR、限制性内切酶消化、连接和转化、标记、Southern 印迹、制备 Sanger 测序和 NGS 样品等。

用户提供的设备和试剂：

• 96 % 乙醇（所需体积等于 试剂盒随附的 4 体积的洗涤液 B浓缩液）
• 异丙醇（约 100 µL 用于从 1 个典型样品中纯化 DNA）
• 1.5 mL 微量离心管（2 管用于从 1 个样品中纯化 DNA）
• 带转子的微型离心机，适用于 1.5 mL 试管，能够离心 >10,000 RPM (6700 × g )
• 加热块（或者，可以使用水浴）
• 精度至少为 0.01 g 的实验室天平

在开始之前

1. 用 96 % 乙醇将洗涤液 B浓缩物稀释5 倍（将 4 体积的 96 % 乙醇添加到瓶子上指定的 1 体积浓缩物中）。在标签上标记已添加乙醇。
2. 如果在凝胶增溶缓冲液中形成任何沉淀 ，请将溶液在不高于 50 °C 的温度下孵育，直至沉淀完全溶解。

从凝胶中提取 DNA 片段

1. 将加热块设置为 50°С。
2. 用干净的手术刀或剃须刀片切除含有 DNA 片段的凝胶切片。通过尽可能靠近 DNA 切割来最小化凝胶切片的大小。
    
   ！减少含有 DNA 片段的凝胶切片的紫外线照射，或在紫外线照射期间将凝胶切片放在玻璃或塑料板上。这最大限度地减少了紫外线引起的 DNA 损伤。
3. 称量干净的 1.5 mL 微量离心管并称量天平。将凝胶切片放入等效干净的 1.5 mL 管中并称重。记录凝胶片的重量。
4. 每毫克琼脂糖凝胶 (4+1) 中加入 4 µL 凝胶溶解 缓冲液（例如，在重量为 100 毫克的凝胶切片中加入 400 微升凝胶溶解缓冲液）。
    
   ！当处理多个样品（含有 DNA 片段的凝胶切片）时，可以方便地向所有样品中添加为最大凝胶切片计算的相同体积的凝胶增溶缓冲液。
5. 将管在 50°C 下孵育 10 分钟，偶尔通过倒置（1-2 次）混合，直到凝胶片完全溶解。
    
   ！对于琼脂糖含量大于 2% 的凝胶，增加孵育时间直到凝胶切片完全溶解。
6. 凝胶片完全溶解后，检查混合物的颜色是否为黄色。如果混合物的颜色是紫色，则  在每 1000 µL DNA 样本中加入 5 µL 中和缓冲液。混合物的颜色会变成黄色。
    
   凝胶溶解缓冲液含有一种颜色 pH 指示剂，可以轻松监测 DNA 与柱膜结合的最佳 pH 值。紫色表示溶液碱性过强。在这种情况下，应添加中和缓冲液以调节 pH 值以实现有效的 DNA 结合。
7. 让所有试管的内容物冷却至室温。
8. 在每毫克溶解琼脂糖凝胶中加入 1 μL 异丙醇（例如，在 100 mg 溶解凝胶切片中加入 100 μL 异丙醇）。充分混合。

DNA纯化

所有离心步骤均在室温下进行，转速为 10,000–13,000 RPM (6700–11,000 x g )。

1. 将旋转柱放入收集管中。将样品添加到色谱柱中（每次加载最多 900 μL）。将色谱柱离心 30 秒。丢弃流出液并将色谱柱放回同一收集管中。对于超过 900 µL 的样品体积，加载剩余部分并重复该过程。
2. 加入 500 µL 洗涤液 B，离心 3 分钟。丢弃流出液并将色谱柱放回同一收集管中。
3. （可选）重复洗涤。加入 500 µL 洗涤液 B，离心 3 分钟。丢弃有流通的收集管。
4. 将旋转柱放入干净的 1.5 mL 微量离心管中。将洗脱缓冲液添加到离心柱膜的中心：当使用结合能力为 5 µg DNA 的离心柱时为 10–50 µL，或当使用结合能力为 20 µg DNA 的离心柱时为 25–100 µL。在室温下孵育 1 分钟。将色谱柱离心 1 分钟。微量离心管包含纯化的 DNA。
    
   ！如需增加 DNA 浓度，请使用少量的洗脱缓冲液。不推荐使用体积小于 10 µL（结合能力为 5 µg DNA 的离心柱）或 25 µL（结合能力为 20 µg DNA 的离心柱）进行洗脱，因为这不足以完全润湿膜，导致 DNA 含量低恢复。为提高 DNA 产量，请使用更高体积的洗脱缓冲液（使用 5 µg DNA 结合能力的离心柱时为 50 µL，或使用结合能力为 20 µg DNA 的离心柱时为 100 µL）。
    
   ！如有必要，可用去离子水洗脱 DNA。

从酶促反应中纯化 DNA 片段

1. 向 1 体积的反应样品中加入 4 体积的 凝胶溶解缓冲液 （例如，向 100 微升反应样品中加入 400 微升凝胶溶解缓冲液）。充分混合。
2. 检查混合物的颜色是否为黄色。如果混合物的颜色是紫色，则  在每 1000 µL DNA 样本中加入 5 µL 中和缓冲液。混合物的颜色会变成黄色。
    
   凝胶溶解缓冲液含有一种颜色 pH 指示剂，可以轻松监测 DNA 与柱膜结合的最佳 pH 值。紫色表示溶液碱性过强。在这种情况下，应添加中和缓冲液以调节 pH 值以实现有效的 DNA 结合。
3. 将 1 体积的异丙醇添加到 1 体积的初始反应溶液中（例如，将 100 µL 异丙醇添加到与 400 µL 凝胶溶解缓冲液混合的 100 µL 初始反应溶液中）。充分混合。
4. 继续执行上面的“DNA 纯化”协议。

笔记

测量 DNA 浓度时，仅使用 试剂盒随附的TE 缓冲液 pH 8.5 或洗脱缓冲液稀释样品。否则，可能会错误地估计DNA 浓度和纯度（分别为 OD ₂₆₀和 OD ₂₆₀ /OD _{280 ）。}
纯化 DNA 的储存：长期储存 -20 °C，短期储存 +4 °С。