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细胞稳转株构建
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艾迪基因
基因编辑服务
株
基因过表达把基因转入靶细胞观察表型变化是基因功能研究的常用手段之一。艾迪基因结合多年细胞生物学经验,建立了一套成熟稳定的基因过表达的实验体系,使用优化升级的过表达载体,可针对多种不同细胞(包括难转染细胞)提供更优质的基因过表达稳转细胞株的构建服务。服务优势:(1)优化升级的过表达载体,更优质的表达效果(2)快速交付,项目周期快至八周(3)具备丰富细胞培养经验服务内容:(1)项目评估(2)细胞抗生素敏感浓度摸索与单克隆形成验证(3)过表达载体构建(4)慢病毒包装与转染(5)阳性多克隆筛选(6)阳性单克隆筛选(7)蛋白免疫印迹实验( WB )服务周期:根据细胞生长特性与基因不同,服务周期在8~16周不等客户提供:靶细胞及其培养方案、基因名称服务流程:
交付标准:1×基因过表达阳性多克隆/单克隆细胞株(复苏) 1×项目结题报告服务保证:(1)项目启动后,密切跟进实验进展,每两周进行一次项目进度汇报。(2)项目结题报告包含实验详细记录等,满足客户后期论证材料需求。(3)基因过表达阳性多/单克隆均经过蛋白免疫印迹实验验证,保证蛋白表达效果。
一、过表达载体构建利用同源重组的方法构建LentiCRISPRv2-GOI过表达载体,采用双酶切的方式获得线性化载体,根据同源重组设计目的片段的引物。目的片段的获得分为两步PCR方法,第一步从模板中扩增出目的片段的ORF,第二步扩增加入Gsg-3×FLAG序列。采用one step cloning试剂盒连接目的片段与线性化载体,利用Amp进行抗性筛选。1、基因序列扩增(图1)
图1 基因序列第一轮扩增
2、基因序列扩增,添加标签及同源序列3、双酶切pLentiCRISPRv2载体
图2 目的基因第二轮PCR及线性化载体纯化结果4、目的基因与线性化载体连接利用ClonExpress II one step coloning Kit连接目的片段和线性化载体。每个实验组各挑取单克隆菌落,于LB/ Amp培养基中扩增,并送样测序。5、LentiCRISPRv2-GOI无内毒素质粒提取二、病毒包装1、培养细胞,配制PEI-Opti-MEM和质粒混合液,将PEI-Opti-MEM加入各质粒混合液中,轻弹管壁混匀,室温静置孵育15~20 min。2、将上混合液小心滴加到培养基中,轻轻晃动摇匀,在培养箱中继续培养18 h。3、18 h后小心吸去培养基,加入5 mL新配制的完全培养基。4、42 h后收集培养上清,离心,0.45µm滤膜过滤,液氮速冻,-80℃保存。三、细胞转染1、配制梯度病毒稀释液2、在六孔板中加入病毒稀释液,随后立即加入细胞,摇匀,以下每孔依次按此操作进行。细胞于培养箱中静置培养48 h。四、阳性多克隆细胞株筛选五、阳性单克隆细胞株筛选1、细胞转染48 h后,更换完全培养基,随后1~2 d更换一次。2、筛选7天后,对照组细胞全部死亡,实验组细胞扩大培养,同时进行单克隆细胞筛选。3、96孔板每孔加100 μL细胞悬液,用封口胶将孔板封好,放于培养箱中培养静置培养48 h后,更换完全培养基,随后1~2 d更换一次,每日观察并记录单克隆形成情况。六、阳性单克隆细胞株验证1、测序验证提取单克隆细胞株基因组DNA,测序验证基因稳定转染单克隆细胞株的基因序列的准确性2、Western blot
图3 阳性单克隆细胞株基因表达验证——Western blot
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