脑心肌炎病毒（EMCV）核酸检测试剂盒(RT-PCR 荧光探

 

【产品名称】

商品名称：脑心肌炎病毒（EMCV）核酸检测试剂盒(RT-PCR 荧光探针法)
Name ：Diagnostic Kit for Encephalomyocarditis Virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)

【包装规格】48 份/盒
 

【预期用途】

本试剂盒适用于检测的心脏、脑组织、全血等标本中脑心肌炎病毒 RNA，适用于脑心肌炎病毒感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。


 

【检验原理】

本试剂盒用一对脑心肌炎病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对脑心肌炎病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
 

【试剂组成】

名          称	规         格
酶液	50μl×1 管
EMCV 反应液	1.0ml×1 管
EMCV 阳性质控品	50μl ×1 管
阴性质控品	250μl ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
 

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 5 次，
有效期 12 个月。
 

【适用仪器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ
Opticon2 等其他荧光定量 PCR 检测仪。
 

【标本采集】

病死或扑杀动物，叏心脏、脑组织；待检活动物，抽取全血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管。
 

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但丌能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）
   1. 样本前处理

每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，叏上清液 100uL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
 

1. 2. RNA 提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的 RNA 提取试剂盒（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。
 

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂	EMCV 反应液	酶液
用量	20μl	1μl

 

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 RNA、阳性质控品、阴性质控品各叏 4μl，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
 

4. PCR 扩增（核酸扩增区）
   1. 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
   2. 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择：

检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。
 

1. 3. 推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1cycle	42℃	20min	否
2	1 cycle	94℃	2min	否
3	40 cycle	94℃	15sec	否
		55℃	30sec	是

 

5. 结果分析判定
   1. 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

1. 2. 结果判断

阳性：检测样本 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测样本 Ct 值＞35.0，重复一次实验，如果 Ct 值仍大于 35.0，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；
阴性：检测不到样本 Ct 值。
 

6. 检测方法的局限性

• 样本检测结果不样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
• 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
• 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
• 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
• 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
• 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
• 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

 

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线且无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。


 

【注意事项】

• 所有操作严格按照说明书进行；
• 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
• 反应液应避光保存；
• 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
• 使用一次性吸头、一次性手套和各区与用工作服；
• 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
• 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
• 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。