序列分析

技术服务详情

蛋白质是由多个氨基酸经过脱水缩合连接在一起形成的。氨基酸是蛋白质的基本组成单元，其排列顺序即蛋白质的序列信息是蛋白质的一级结构。蛋白质的一级结构决定了蛋白质其它高级结构，并定义了蛋白质的功能。因此，对蛋白质进行序列分析有助于蛋白质的结构和功能的分析。

序列分析

蛋白质的序列分析技术主要可以分为质谱法和非质谱法。其中质谱法可以用于蛋白质的末端（N端或C端）测序，也可以用于蛋白质的全序列测定、从头测序和突变分析。非质谱法中zuì有名的当属Edman降解法，它主要用于蛋白质的N端测序。

百泰派克生物科技提供以下多种蛋白质序列分析服务：

1. 基于质谱的序列分析

基于质谱的蛋白质、抗体、多肽等样品的序列分析，是对样品氨基酸序列的分析。质谱测序即指基于质谱对样品一级结构氨基酸序列的测定。在进入质谱序列分析之前，我们先对几个定义进行简单的介绍。氨基酸是含有胺（-NH2）和羧基（-COOH）官能团以及每个氨基酸特有的侧链（R基团）的有机化合物。肽是由肽键连接的两个至五十个氨基酸组成的短链。多肽是更长、连续、不分支的肽链，zuì多可包含约五十个氨基酸的较长的肽链。包含五十个以上氨基酸的多肽/肽链被称为蛋白质。蛋白质由一种或多种以生物学功能基团方式排列的多肽组成，通常可结合至配体（例如辅酶和辅因子），另一种蛋白质，其他大分子（例如DNA或RNA）或更复杂的大分子装配体。抗体（Ab），也称为免疫球蛋白（Ig）则是主要由浆细胞产生的大的Y形蛋白质，被免疫系统用来中和病原体，例如病原细菌和病毒。

相关服务：

基于质谱的蛋白测序

基于质谱的抗体测序

基于质谱的多肽测序

 

较Edman降解法而言，质谱法测序的优点在于，质谱法更敏感，可以更快地裂解肽，可以识别末端封闭或修饰的蛋白样品。百泰派克生物科技利用现有的高分辨率质谱技术平台，提供以质谱为基础的序列分析服务，可实现对所测定靶蛋白序列100%的覆盖。

质谱测序示意图

蛋白样品序列分析过程一般只会使用Trypsin对蛋白进行酶切，鉴定到的肽段覆盖率大概在60%。为了得到靶蛋白的全部序列信息，百泰派克生物科技会选用在蛋白序列分析过程中常用的6种蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Asp-N、Glu-C、Lys-C和Lys-N）分别对靶蛋白进行酶切和质谱测定，在得到碎裂肽段片段的同时，经过肽段之间的拼接完成蛋白序列100%的测定。百泰派克使用Thermo公司zuì新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪实现对蛋白样品的序列分析，Obitrap Fusion Lumos质谱仪是现在分辨率和灵敏度zuì高的质谱仪，保证了低丰度肽段碎裂片段鉴定的灵敏度；同时在肽段碎裂过程中采取HCD与ETD结合的模式，保证肽段碎裂片段的完整性。可以实现蛋白样品的N端，C端序列分析，蛋白全长序列分析。对未知理论序列的样品，可通过从头测序法进行序列分析。

百泰派克提供以下基于质谱的序列分析服务：

蛋白质N/C端测序

蛋白全序列测定

基于Top down自上而下法的蛋白质测序

 

2. 基于Edman降解的蛋白N端序列分析

在蛋白质测序前，蛋白样品首先经过SDS-PAGE的分离，保证样品的纯度满足测序的要求；随后将SDS-PAGE上的蛋白样品转移到PVDF膜上；经过染色确定把蛋白条带并切出；使用Edman测序仪对得到的PVDF膜上的蛋白样品进行分析。Edman降解测序是通过循环反应从蛋白质的N端开始逐个鉴定氨基酸的种类，从而对蛋白质的N端序列进行测定。每一个Edman测序反应包括3步：第一步是在碱性条件下，PITC与蛋白N端的游离氨基结合；第二步是在酸性溶液中，N端残基被切除；第三步是PITC结合的残基转化成为更为稳定的PTH残基，经过在线的HPLC分析，根据洗脱时间确定氨基酸种类。

Edman测序反应过程

基于Edman降解的蛋白质N端测序服务流程

Edman测序实验流程图

应用领域

• 蛋白表达产物的验证：重组蛋白插入位点和表达顺序是否正确；

• 细胞株建立和发酵过程中蛋白产物的验证：验证细胞株建立和发酵过程中蛋白产物N端甲硫氨酸和信号肽是否正确处理；

• 蛋白降解/酶切分析：对降解/酶切形成的新蛋白片段N端进行分析，确定断裂/酶切位点；

• De-novo测序：对于蛋白数据库中不存在的全新蛋白序列进行分析。

 

关于样品

PVDF膜类样品的准备过程

（1）样品电泳和电转

a. 对蛋白样品进行1D或者2D跑胶

b. 将蛋白胶上的样品转移至PVDF膜上；注意：千万不要使用硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membranes）

c. 在此过程中请佩戴手套和头套，避免自身角蛋白对测序结果的影响

（2）PVDF膜的染色

a. 染色过程中可以使用考马斯亮蓝或者立春红对PVDF膜进行染色；注意：千万不要使用银染的方法进行染色

b. 染色完成之后，可以使用双蒸水对PVDF膜进行清洗

c. 如果转膜的缓冲液中含有甘氨酸，需要对PVDF膜进行多次冲洗，以避免甘氨酸对后续分析的影响

d. 更详细的样品准备步骤，见Edman测序样品准备Protocol

（3）靶蛋白条带获取

a. PVDF膜染色后，靶条带清晰可见，用洁净的解剖刀将靶蛋白条带切下

b. 在蛋白量允许的情况下，可以准备2-3条靶条带以增加靶蛋白的量

（4）样品运输

对切下的蛋白条带进行密闭包装，使用冰袋运输即可

 

溶液样品的准备过程

（1）蛋白的纯度和用量

a. 样品需要量在1-10 ug

b. 样品纯度要＞90%

c. Buffer中不要使用表面活性剂，并尽可能降低溶液的盐浓度

d. Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢剂，ammonium sulfate和其他的铵盐均会对后续的氨基酸鉴定产生影响，在样品准备过程中要避免使用

e. 样品准备过程全程佩戴口罩和头套，避免角蛋白的影响

（2）蛋白样品的运输

a. 液体样品推荐干冰运输

b. 液体样品也可以在冷冻抽干或者真空抽干后，使用冰袋运输

 

研究案例

如下图所示，通过Edman测序，可提供鉴定的氨基酸的详细信息。

Edman测序研究案例

 

3.基于PCR扩增的单克隆抗体测序服务

尽管杂交瘤细胞能够无限增殖并表达抗体，但是在长时间的细胞增殖和蛋白表达可能导致抗体基因发生突变以致表达的抗体失效。因此，获取杂交瘤细胞单克隆抗体基因序列对于大规模稳定表达单克隆抗体尤为重要。为了更好解决科研用户的需求，百泰派克推出了基于PCR扩增技术的单克隆抗体基因测序服务。相较于对单克隆抗体氨基酸序列的测序，单克隆抗体基因测序可以提供更准确更可靠的结果，并且能够更为准确地区分亮氨酸/异亮氨酸等在质谱鉴定中较难区分氨基酸。

百泰派克公司提供完善的单克隆抗体基因测序服务，使用专业的兼并引物设计（degenerate primer）和测序方案，同时优化经济成本和时间成本，为客户提供快速准确的抗体可变区域以及全长基因测序服务。我们提供优质的一站式服务，一次性解决您的单克隆抗体测序需求。同时根据客户的具体需求，我们也可以提供相应的定制服务。

基于PCR扩增的单克隆抗体测序服务实验流程

单克隆抗体测序服务实验流程

技术特点

• 提供对所有常见的种属来源抗体的序列分析服务，可对轻链、重链或全长进行测序

• 高效快速的分析和交付速度

• 定制引物集，分析多个DNA克隆，确保精准高质量测序分析

• 对抗体易突变的FR1区进行序列分析

 

关于样品

样品形式	冻存的单克隆抗体杂交瘤细胞
数量	1x10^7

注意：样品运输请使用足量的干冰运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。

 

4.从头测序服务

蛋白分子在单克隆抗体药物，生物疫苗，诊断试剂盒研发等生物药物领域中扮演了关键的角色。准确测定蛋白质序列在研发商业单克隆抗体，疫苗，以及试剂盒等药物方面有着很重要的作用。百泰派克公司基于高分辨率质谱仪Obitrap Fusion Lumos，结合丰富的生物信息学分析经验，建立了全新一代蛋白从头测序和突变分析（De Novo Sequencing）平台，能够实现对单克隆抗体一级结构序列，蛋白质序列和突变进行快速准确的分析。

从头测序

从头测序服务优势

1. 采用高分辨率质谱仪器Obitrap Fusion Lumos

2. 样品覆盖率高：覆盖率高达100%

3. 首次氨基酸准确率高：准确率高达95%

4. 样品用量低：只需样品量达100ug，即可完成检测

 

百泰派克提供以下从头测序服务：

单克隆抗体从头测序

蛋白从头测序和突变分析

多肽从头测序

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。