磷脂酶DPLD测试盒

 
磷脂酶DPLD测试盒



微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。

测定原理：
磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。

试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体102mL×瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体3mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加1mL无水乙醇充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。
标准品：液体1mL×1支，4℃避光保存。

酶液提取：
1.组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。
2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。
3.血清：直接测定。                   



测定操作：

	空白管	标准管	测定管
试剂一（μL）	20
试剂二（μL）	30	30	30
标准品（μL）		20
样品（μL）			20
试剂三（μL）	10	10	10
充分混匀，30℃反应30min，沸水浴1min，打开盖子，自然冷却2min。
试剂四（μL）	140	140	140
30℃反应30min，于微量石英比色皿/96孔板，空白管调零，测定500nm处吸光值，分别记为A标准管和A测定管。

酶活计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /mg prot）= ×C标准÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /g 鲜重）=  ×C标准÷W÷T = 16.7×÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /104 cell）= ×C标准÷细胞数量÷T = 16.7×÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /mL）=  ×C标准÷T=16.7×
C标准：标准品浓度，500nmol/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min
b.用96孔板测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /mg prot）= ×C标准÷Cpr÷T= 16.7×÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /g 鲜重）=  ×C标准÷W÷T = 16.7×÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /104 cell）= ×C标准÷细胞数量÷T = 16.7×÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD活性（nmol/min /mL）= ×C标准÷T=16.7×
C标准：标准品浓度，500nmol/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min

注意事项：
1.显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min后取上清测定。
2.吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。