黄嘌呤氧化酶XOD试剂盒

 
黄嘌呤氧化酶XOD试剂盒



微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
XOD（EC 1.17.3.2）催化黄嘌呤氧化生成尿酸和超氧阴离子，是活性氧主要来源之一；同时也是核苷酸代谢的关键酶之一。XOD主要分布于哺乳动物的心，肺，肝脏等组织中，当肝功能受损时，XOD大量释放到血清中，对肝损害的诊断具有特异性的意义。

测定原理：
XOD催化黄嘌呤产生尿酸，尿酸在290nm下有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：30mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存。

粗酶液提取： 
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。



操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至290nm，蒸馏水调零。
2、XOD检测工作液的配制：用时在每瓶试剂二中加入15mL试剂一，充分混匀，待用；现配现用；
3、测定前将XOD检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
4、准备96孔UV板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于340nm务必使用UV板）。
5、在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μL样本和250μL工作液，立即混匀并计时，记录290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

XOD活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）XOD计算：
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=2131×ΔA
2、组织、细菌或细胞中XOD计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V样÷V样总）÷T=2131×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=4.26×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.6×10-4 L；ε：尿酸摩尔消光系数，1.22×104 L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）XOD计算：
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD（nmol/min/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=4262×ΔA
2、组织、细菌或细胞中XOD计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T =4262×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W× V样÷V样总）÷T =4262×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。
XOD（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=8.52×ΔA
黄嘌呤氧化酶XOD试剂盒V反总：反应体系总体积，2.6×10-4 L；ε：尿酸摩尔消光系数，1.22×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500万。