多胺氧化酶PAO测试盒

 
多胺氧化酶PAO测试盒



微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
多胺氧化酶是催化生物体内多胺氧化的关键酶，通过调节体内多胺水平和生成物的浓度，参与各种植物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程。

测定原理：
PAO催化多胺氧化产生过氧化氢，在过氧化物酶存在的条件下与底物显色，在550nm下有特征吸收峰，通过测定吸光值增加速率来反映PAO活性。

需自备的仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：
试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体3mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体1.5mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：液体1.5mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。



测定步骤：
1、酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm。
2、样本测定

试剂名称（µL）	测定管
试剂一	140
试剂二	20
试剂三	10
样本	20
试剂四	10
迅速混匀，于550nm下测定初始吸光值A1与30min后吸光值A2。ΔA=A2-A1。

PAO活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。
PAO（U/mg prot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.001÷T =333.33×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。
PAO（U/g 鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.001÷T =333.33×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。
PAO（U/104 cell）＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.001÷T =0.667×ΔA
（4）按液体体积计算
单位的定义：每mL液体样本在每mL反应体系中每分钟A550变化0.001为一个酶活力单位。
PAO（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.001÷T =333.33×ΔA
多胺氧化酶PAO测试盒V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。