酪氨酸解氨酶TAL测试盒

 
 
酪氨酸解氨酶TAL测试盒



微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
TAL广泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。TAL能够跃过肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）直接将酪氨酸转化为香豆酸，香豆酸可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。

测定原理：
TAL能够分解酪氨酸产生香豆酸，使反应溶液333nm下的吸光度随反应时间而上升，根据吸光度的变化率可计算出TAL活性。

需自备的仪器和用品：
酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；
试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）果汁等液体样品：直接检测。



测定步骤：
1、酶标仪预热30min以上，调节波长至333nm。
2、准备96孔UV板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于340nm务必使用UV板）。
3、试剂二的配置：临用前在试剂二瓶中加入10mL试剂一充分溶解待用（用不完的试剂4℃保存一周，注意现配现用），在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。
4、在EP管中依次加入如下试剂

试剂名称（μL）	测定管	对照管
样本上清	40	40
试剂一		360
试剂二	360
充分混匀，40℃保温60min
试剂三	20	20

混匀，10000g 4℃离心5min，取200μL上清至96孔UV板，333nm下测定吸光值A测定与A对照，ΔA=A测定-A对照

TAL活性计算：
1、血清（浆）或果汁TAL活性
单位的定义：每分钟每mL血清（浆）或果汁在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化
0.005为一个酶活力单位。
TAL（U/mL）=ΔA×V反总÷( V样÷V样总)÷0.005÷T =35×ΔA
2、组织、细菌或细胞TAL活性
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化0.005为一个
酶活力单位。
TAL（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.005÷T =35×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化0.005为一个
酶活力单位。
TAL（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.005÷T =35×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使333nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
TAL（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.005÷T =0.07×ΔA
酪氨酸解氨酶TAL测试盒V反总：反应体系总体积，0.42mL；V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。