果糖-1,6-二磷酸FDP测试盒

果糖-1,6-二磷酸FDP测试盒
微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
果糖1,6-二磷酸是机体内的高能代谢物和代谢调控剂，是糖酵解途径的重要中间体，广泛存在于动植物和微生物体内，能影响细胞内钾离子的浓度，改善葡萄糖和其他能量底物的代谢，促进组织氧的释放，广泛应用于临床医药制剂。

测定原理：
醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸降解，产物与DNPH缩合成紫红色物质，在540nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：
天平、低温离心机、研钵、恒温水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。

试剂组成和配制： 
试剂一：液体110mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体0.4mL×1支，4℃避光保存。
试剂三：液体4mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体16mL×1瓶，4℃保存。

样品处理：
1.组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清待测。
2.细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清待测。
3.液体：直接检测。

测定操作：

	对照管	测定管
样品（μL）		20
蒸馏水（μL）	20
试剂一（μL）	44	40
试剂二（μL）		4
充分混匀，37℃反应30min
试剂三（μL）	40	40
充分混匀，37℃温育10min
试剂四（μL）	160	160

果糖-1,6-二磷酸FDP测试盒充分混匀，于37℃温育10min，于微量石英比色皿/96孔板，蒸馏水调零，测定540nm处吸光值，记为A对照管和A测定管，△A=A测定管- A对照管，对照管只要做一管。

计算公式：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y= 0.6971x+0.0012，R2=0.9983
1．按照质量计算
FDP（mg/g 鲜重）= (△A-0.0012) ÷0.6971÷（W÷V样总）= 1.43×(△A-0.0012)÷W
2．按照细胞数量计算
FDP（mg/104 cell）= (△A-0.0012) ÷0.6971÷（细胞数量÷V样总）=1.43×(△A-0.0012)÷细胞数量
3．按照液体体积计算
FDP（mg/mL）= (△A-0.0012) ÷0.6971= 1.43×(△A-0.0012)
W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y= 0.3486x+0.0012，R2=0.9983
1．按照质量计算
FDP（mg/g 鲜重）= (△A-0.0012) ÷0.3486÷（W÷V样总）= 2.87×(△A-0.0012)÷W
2．按照细胞数量计算
FDP（mg/104 cell）= (△A-0.0012) ÷0.3486÷（细胞数量÷V样总）= 2.87×(△A-0.0012)÷细胞数量
3．按照液体体积计算
FDP（mg/mL）= (△A-0.0012) ÷0.3486= 2.87×(△A-0.0012)
W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL

注意事项：
低检出限为1.72 mg/L。