甲醛脱氢酶FDH测试盒

甲醛脱氢酶FDH测试盒
微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物，对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶（ADH）的家庭成员之一，广泛存在于原核和真核生物中，该酶能利用NAD+作为辅酶，将有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途径中的关键酶。

测定原理：
甲醛脱氢酶催化甲醛和NAD+产生NADH，在340nm处的吸光值会增加，测定340nm处的吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。

自备实验用品及仪器：
天平、离心机、酶标仪、96孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入6mL水溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1支，4℃保存；临用前加入1.5mL水溶解待用。
试剂四：液体1.5mL×1支，4℃避光保存。

FDH提取：
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心20min。
2.细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.液体：直接检测。



甲醛脱氢酶FDH测试盒
测定操作表：
1、酶标仪预热30min，调节波长至340nm。
2、操作表
在96孔板中加入如下试剂

	测定管
样本（µL）	20
试剂一（µL）	110
试剂二（µL）	50
试剂三（µL）	10
试剂四（µL）	10

混匀，于340nm下测定初始吸光值A1与5min后的吸光值A2，△A=A2-A1。
若样本数量较多，可将试剂按比例配成工作液使用。

FDH酶活计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T = 643×△A÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每克样品每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活（nmol/min/g 鲜重）= ×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T =643×△A÷W
（3）按照细胞数量计算
酶活定义：每104个细胞每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活（nmol/min/104cell）= ×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T= 643×△A÷细胞数量
（4）按液体体积计算
酶活定义：每mL样本每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反总÷V样÷T=643×△A
：NADH微摩尔消光系数，6.22×10-3 L/µmol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T，反应时间，5min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g