过氧化物酶Peroxidase，POD试剂盒

过氧化物酶Peroxidase，POD试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

测定原理：
POD催化H2O2氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水



试剂的组成：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体100μL×1支，4℃保存；
试剂三：液体100μL×1支，4℃保存。

粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤和加样表：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至470nm，蒸馏水调零。
2、工作液的配制：临用前将试剂一、试剂二、试剂三按照2.6（mL）：1.5（μL）：1（μL）的比例混匀；在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10min以上；现配现用。
3、在1mL玻璃比色皿中加入50μL样本和950μL工作液，混匀，记录470nm下1min时吸光值A1和2min后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

注意：
如果ΔA小于0.005，可将反应时间延长到5min。如果ΔA大于0.5，可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。

过氧化物酶Peroxidase，POD试剂盒
POD活性计算：
1、血清（浆）POD活性
单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。
计算公式：
POD（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T =2000×ΔA
2、组织、细菌或细胞POD活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。
POD（U/mg prot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。
POD（U/g 鲜重）＝ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =2000×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。
POD（U/104 cell）＝ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =4×ΔA
V反总：反应体系总体积，1mL； V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500万。