Qiagen12866-25强力土壤总RNA提取试剂盒（MO

Qiagen12866-25强力土壤总RNA提取试剂盒（MOBIO）

 

 

名称	品牌	货号	规格	保存
强力土壤总RNA提取试剂盒 RNeasy PowerSoil Total RNA Kit	QIAGEN	12866-25	kit	室温保存

 

产品介绍

QIAGEN RNeasy PowerSoil总RNA套件专为从土壤中的生物体中提取总RNA而设计，能够可靠地提供用于定性和定量RT-PCR分析的RNA。该套件能有效去除土壤中提取的RNA中的腐殖质、富里酸及其他RT-PCR抑制剂。无论是堆肥、粪便、河口沉积物还是其他富含有机物的土壤类型，使用此套件都能成功提取出完整且适合RT-PCR扩增的RNA。

LifeGuard土壤保存溶液是一种专为RNA提取的土壤收集和运输设计的处理方案。该溶液能够保护土壤中的细菌活性，同时保持它们处于休眠状态。它能有效防止RNase和DNase的活性，确保在野外采集的样本上进行准确、全长cDNA合成及16S rRNA谱型分析。使用LifeGuard溶液稳定后的土壤，其微生物群落的特征可以在-20°C下维持长达30天，在4°C下维持1周，在室温下维持3天。

我们不推荐使用RNALater和RNAProtect保存土壤中的核酸。

对于最多2克的土壤样本，均质化过程在含有碳化硅珠、裂解缓冲液、苯酚/氯仿/isoamyl alcohol（pH 6.5-8）和溶液IRS的15毫升试管中进行，以确保所有微生物完全裂解并中和RNase。裂解后的样品通过沉淀浓缩总核酸，沉淀物再悬浮于优化的缓冲液中，该缓冲液适用于阴离子交换重力流柱。RNA使用高盐缓冲液洗脱后再次沉淀，最终纯化的RNA重新悬浮于无

RNase的水中。如果需要，可以使用RNeasy PowerSoil DNA洗脱试剂盒（产品编号12867-25）从RNA中单独纯化DNA。分离出的核酸已准备好用于酶促应用。

产品特征

◆通过从多达 2 克土壤中纯化 RNA，从生物质样品中获得高 RNA 产量

◆从所有土壤样品类型（包括困难的环境样品）中分离出高质量的 RNA

◆轻松去除 PCR 抑制剂，获得高纯度 RNA，可直接用于下游应用

产品规格

 

特征	规格
每次运行或每次制备的时间	2.5 小时
样本量	2 克
吞吐量	1-4 个样品
样品类型	所有土壤样品，包括堆肥、沉积物和粪便
加工	胎圈打磨
格式	阴离子交换柱

 

Kit Contents

 

RNeasy PowerSoil Total RNA Kit Catalog no. Number of preps	(25) 12866-25 25
PowerBead Tubes, Carbide	25
PowerBead Solution	2 x 42 ml
Solution SR1	7 ml
Solution IRS	2 x 15 ml
Solution SR3	42 ml
Solution SR4	6 x 27.5 ml
Solution SR5	110 ml
Solution SR6	28 ml
Solution SR7	2 x 1.5 ml
JetStar 2.0 Mini Columns	25
Collection Tubes (2.2 ml)	25
Collection Tubes (15 ml)	2 x 50
Quick Start Protocol	1

 

用户需提供的设备和试剂

在处理化学品时，应始终穿戴合适的实验服、一次性手套和护目镜。如需更多信息，请查阅产品供应商提供的适当安全数据表（SDS）。

●可离心15 ml试管的离心机（最低2500 x g）

●Microcentrifuge (13,000 x g)

●Pipettors (20 μl–1000 μl)

●血清学移液管（1 ml和10 ml）

●旋涡精灵®2旋涡

●旋涡管接头，用于4（15 ml）试管（目录号13000-V1-15)

●无RNase手套（产品目录号：1556-S、1556-M和1556-L)

●用于RNase去除的实验室清洁剂（产品编号：12095-500)

●苯酚/氯仿/isoamyl alcohol溶液

●热阻块设定为45°C（可选）

 

方案：有经验的用户

开始前的重要事项

 ●如果溶液IRS已沉淀，加热至60°C直至沉淀物溶解。

 ●在室温（15-25°C）下进行所有离心步骤。

 ●始终佩戴无RNase手套，并从工作区域清除RNase。

程序

1. 向15 ml PowerBead管（提供）中加入最多2g土壤。有关处理的土壤量的信息，请参阅故障排除指南。

2. 加入2.5 ml PowerBead溶液、0.25 ml溶液SR1和0.8 ml溶液IRS。

3. 加入3.5 mL苯酚/氯仿/isoamyl alcohol(pH 6.5-8.0，[用户自备]）。盖上盖子并涡旋振荡PowerBead管，直至两相层消失。

4. 将PowerBead管置于涡旋混合器适配器（产品目录号13000-V1-15)上，并以最大速度涡旋15分钟。

5. 取出PowerBead管，以2500 x g离心10分钟。

6. 将上层水相（避开界面和下层酚层）转移至提供的15毫升干净收集管中。丢弃酚/氯仿/isoamyl alcohol混合物。注意：在有机质含量高的土壤中，两相层会变得厚实且坚固，可能需要刺穿以去除底部的酚层。

7. 添加1。向水相中加入5毫升溶液SR3并涡旋混合。在2-8°C条件下孵育10分钟，随后在室温下以2,500 x g离心10分钟。

8. 转移上清液至新的15 mL收集管（提供），同时避免扰动沉淀物（如有）。

9. 向收集管中的上清液中加入5 mL溶液SR4，颠倒或涡旋混匀。在室温下孵育30分钟。

注：之前方案的说明是在-20°C下培养。如果您使用之前的方案对您的土壤类型获得了

良好的结果，您可以继续遵循该方案。

10. 以2500 x g离心30分钟。

11. 倾析上清液，并将15 ml收集管在纸巾上倒置5分钟。

12. 摇匀溶液SR5，混合后向15 mL收集管中加入1 mL。通过反复吸打或涡旋使沉淀物完全重新悬浮。

注：如果难以重新悬浮沉淀物，将试管置于45°C的热块或水浴中10分钟，随后进行涡旋。重复此操作直至沉淀物重新悬浮。

13. 为每个RNA分离样品准备一个JetStar Mini柱（已提供）：

13a.拆下15 ml收集管（已提供）的盖子，将JetStar Mini柱放入其中。该柱将悬挂在收集管内。

13b.向JetStar Mini色谱柱中加入2 mL溶液SR5。使其完全通过色谱柱重力流动，并收集在15 mL收集管中。

注：在加载RNA分离样品前，不要让色谱柱干燥。

14. 将第12步的RNA分离样品加入到JetStar Mini柱中，使其通过柱子重力流入15 ml收集管中。

15. 向JetStar Mini色谱柱中加入1 mL溶液SR5，使其完全重力流入15 mL收集管。

16. 将JetStar Mini柱转移至新提供的15 ml收集管中。摇匀溶液SR6以混合，然后向JetStar Mini柱中加入1 ml溶液以洗脱结合的RNA。让溶液SR6通过重力流入15 ml收集管中。

17. 将洗脱的RNA转移至提供的2.2毫升收集管中。加入1毫升SR4溶液，充分混匀后，在-15°C至-30°C条件下孵育至少10分钟。

18. 以13,000 x g离心2.2 ml收集管15分钟，使RNA沉淀。

19. 倾倒上清液，将2.2 ml收集管倒置在纸巾上将颗粒风干10分钟。

20. 将RNA沉淀物重新悬浮于100微升的溶液SR7中。

 

方案：详细

开始前的重要事项

●如果溶液IRS已沉淀，加热至60°C直至沉淀物溶解。

●在室温（15-25°C）下进行所有离心步骤。

●始终佩戴无RNase手套，并从工作区域清除RNase。

程序

1. 向15 ml PowerBead管（提供）中加入最多2g土壤。有关处理的土壤量的信息，请参阅故障排除指南。

2. 加入2.5毫升PowerBead溶液、0.25毫升SR1溶液和0.8毫升IRS溶液。注意：PowerBead溶液是一种缓冲液，用于分散细胞和土壤颗粒。SR1溶液含有SDS和其他破坏剂，有助于细胞完全裂解。此外，SDS是一种阴离子洗涤剂，能够分解多种生物细胞膜上的脂肪酸和脂质。IRS溶液是一种沉淀试剂，可以去除非DNA的有机和无机物质，包括细胞碎片和蛋白质。

注：如果溶液变冷，SR1溶液将形成白色沉淀。加热至60℃可溶解SDS且不会对其他破坏剂造成损害。

3. 加入3.5 mL苯酚/氯仿/isoamyl alcohol(pH 6。5–8.0，[用户自供]）。盖上盖子并振荡PowerBead管，直至两相层消失。

注：苯酚/氯仿/isoamyl alcohol可最大限度提高裂解效率和产量。裂解后的细胞成分被溶剂捕获，蛋白质变性，核酸留在溶液中。

4. 将PowerBead管置于涡旋适配器（产品目录号13000-V1-15)上，并以最大速度涡旋15分钟。

注：细胞通过第1至3步的化学试剂组合及涡旋产生的机械摇动进行裂解。使用涡旋适配器可最大化均质化效果，从而提高DNA产量。不建议使用胶带固定试管。

5. 取出PowerBead管，以2500 x g离心10分钟。

注：离心会导致样品混合物的相分离。离心后可见三个相：下层有机相含有蛋白质和细胞碎片，中间相含有腐殖质和其他有机和无机物质，上层水相含有总核酸。

注：界面的厚度将取决于样品类型。有机物含量高的样品将具有较厚的界面。

6. 将上层水相（避免接触中间相和下层酚层）转移到提供的15毫升干净收集管中。丢弃酚/氯仿/isoamyl alcohol混合物。注意：在有机物含量高的土壤中，两相层会变得厚实且坚固，可能需要刺穿以去除底部的酚层。将含有样本总核酸的上层水相转移至新的试管中。细胞碎片、蛋白质和有机物质会被留在原地。操作时要小心，避免将下层或中间相的物质转移过来。

7. 向水相中加入1.5 mL溶液SR3并涡旋混匀。在2-8°C下孵育10分钟，然后在室温下以2,500 x g离心10分钟。

注：溶液SR3是进一步去除蛋白质和细胞碎片的二次沉淀步骤。

8. 转移上清液至新的15 mL收集管（提供），同时避免扰动沉淀物（如有）。

注：将含有核酸的上清液转移至新的15 ml试管中。留下非核酸材料。

9. 向收集管中的上清液中加入5 mL溶液SR4，颠倒或涡旋混匀。在室温下孵育30分钟。

注：之前方案的说明是在-20°C下培养。如果您使用之前的方案对您的土壤类型获得了良好的结果，您可以继续遵循该方案。

10. 以2500 x g离心30分钟。

11.倾倒上清液，并将15 ml收集管在纸巾上翻转5分钟。注意：溶液SR4为100%异丙醇。核酸沉淀，弃去异丙醇。

12. 摇匀溶液SR5，混合后向15 mL收集管中加入1 mL。通过反复吸打或涡旋使沉淀物完全重新悬浮。

注：如果难以重新悬浮沉淀物，将试管置于45°C的热块或水浴中10分钟，随后进行涡旋。重复此操作直至沉淀物重新悬浮。

溶液SR5是一种专有的盐溶液，用于重新悬浮第11步中沉淀的核酸。它还用于在第13步中平衡JetStar Mini柱，并在第15步中清洗和制备该柱以进行RNA洗脱。

13. 为每个RNA分离样品准备一个JetStar Mini柱（已提供）：

13a.拆下15 ml收集管（已提供）的盖子，将JetStar Mini柱放入其中。该柱将悬挂在收集管内。

13b.向JetStar Mini色谱柱中加入2 mL溶液SR5，使其完全通过色谱柱重力流动，并收集至15 mL收集管中。

注：在加载RNA分离样品前，不要让色谱柱干燥。

14. 将第12步的RNA分离样品加入到JetStar Mini柱中，使其通过柱子重力流入15 ml收集管中。

15. 向JetStar Mini色谱柱中加入1 mL溶液SR5，使其完全重力流入15 mL收集管。

注：将样品加入到JetStar Mini柱中，核酸与柱基质结合。然后用第二体积的溶液SR5对捕获柱进行洗涤，以确保在洗脱RNA之前，未结合的污染物已从样品和柱中去除。

16. 将JetStar Mini柱转移至新提供的15 ml收集管中。摇匀溶液SR6以混合，然后向JetStar Mini柱中加入1 ml溶液以洗脱结合的RNA。让溶液SR6通过重力流入15 ml收集管中。

注：溶液SR6是一种专有的盐溶液，可优先释放JetStar Mini柱中的RNA，而将DNA、残留碎片和抑制物质保留在柱中。

17. 将洗脱的RNA转移至提供的2.2毫升收集管中。加入1毫升SR4溶液，至少摇晃一次以混合均匀，并在-15°C至-30°C的温度下孵育至少10分钟。

18. 以13,000 x g离心2.2 ml收集管15分钟，使RNA沉淀。

19. 倾析上清液，将2.2 ml收集管倒置在纸巾上10分钟，使沉淀物风干。

注：溶液SR4为100%异丙醇。从捕获柱洗脱的RNA沉淀、离心并允许其自然干燥，然后重新悬浮和浓缩。

20. 将RNA沉淀物重新悬浮于100微升的溶液SR7中。此时，RNA已准备好用于后续应用。

注：溶液SR7是用于重新悬浮沉淀RNA的无RNase/DNase水。溶液SR7不含EDTA。对于样品的长期储存，可使用10 mM Tris（pH 8.0）或TE缓冲液重新悬浮沉淀的RNA。

 

方案：LifeGuard土壤保持溶液

程序

1. 每1克土壤中加入2至2.5体积的LifeGuard土壤保存液。若直接在RNeasy PowerSoil15毫升PowerBead管中收集土壤，则需向2克土壤中添加5毫升LifeGuard土壤保存液。

注：如果使用的是沉积物样品，每克湿样品重量应使用3体积的LifeGuard土壤保存溶液。

2. 涡旋或手动混合溶液和土壤，直到整个样本被溶液浸透。多余的LifeGuard溶液应覆盖在土壤样本上。

3. 在室温（2-8°C）或-20°C条件下储存。当准备处理RNA时，以2500 x g离心5分钟以收集土壤。从试管中移除LifeGuard溶液。

4. 如果您直接在RNeasy PowerSoil 15 ml PowerBead管中收集土壤，则离心后可去除LifeGuard溶液，并继续执行RNeasy PowerSoil总RNA分离试剂盒方案的第2步。

5. 如果在另一个容器中稳定了土壤，请称量所需的土壤量，转移至RNeasy PowerSoil 15ml PowerBead管或锥形管中，然后离心以去除LifeGuard溶液。

注：使用LifeGuard对几种不同土壤进行了测试，每种土壤的生物量和含水量各不相同。由于试剂稀释，沉积物样品需要更高体积的LifeGuard（3：1）。

注意：生物质含量可能在不同温度下稳定土壤，并影响LifeGuard冻结群落剖面的能力。对于微生物含量未知或温度可能超过室温（22-25°C）的土壤，建议将其储存在-20°C或2-8°C的环境中，以确保群落剖面的原始状态，并且每克土壤使用超过2.5毫升的LifeGuard。对于长期储存和运输（超过30天），应将稳定的土壤储存在-15°C至-30°C的环境中。

 

故障排除指南

本故障排除指南可能有助于解决可能出现的任何问题。如需更多信息，请参阅我们技术支

持中心的常见问题页面：www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx。QIAGEN技术服务部的

科学家们随时准备解答您关于本手册中的信息和/或协议，以及样本和检测技术的任何疑问

（如需联系信息，请访问www.qiagen.com)。

意见和建议

土壤处理

a) 需处理的土方量

可使用RNeasy PowerSoil总RNA试剂盒处理多达大多数土壤类型为2克。如需了解使用更大样本量的建议，请联系技术支持部门获取建议。对于有机物含量较高的土壤，通常1克土壤即可提供足够的RNA，同时减少纯化过程中DNA残留的可能性。对于沉积物样本，可以使用更多的土壤。我们曾使用RNeasy PowerSoil TotalRNA Kit提取高达5克的沉积物样本。您可以在步骤9中增加溶液SR4的体积，使其与裂解液的体积相等。

b) 处理不同类型的土壤

RNA的产量和纯度将取决于处理的土壤类型。RNeasy PowerSoil总RNA试剂盒已通过多种具有广泛物理、化学和生物特性的土壤类型验证。某些土壤和沉积物可能含有过量的盐分。这在第10步后通过一个大的白色或黄

色盐粒来体现。这种盐粒可能会导致核酸产量减少。如果你有富含盐分的土壤或沉积物，为了防止在加入SR4溶液后盐粒沉淀，应将样品在室温下孵育30分钟，而不是-20°C。按照方案的其他步骤进行操作。

程序

a) 苯酚、氯仿、isoamyl alcohol的相分离

为了确保酚/氯仿/isoamyl alcohol与水相的有效分离，需在室温下以2500 x g的离心力对15毫升试管进行至少10分钟的离心（步骤5）。离心后，酚/氯仿/isoamyl alcohol层与水层之间的界面厚度会因土壤中的有机物含量不同而有所变化。在去除上层水相时，应小心避免接触下层酚相和中间相。该溶液含有蛋白质和脂质。如果移除部分酚层或界面，可以重新离心转移的含水相试管，以获得仅能去除水相的相分离。或者，可以向受酚或界面污染的含水相中加入等体积（2毫升）的氯仿，倒置或涡旋混合，然后在室温下以2500 x g离心10分钟。移除上层水相，丢弃下层的氯仿/酚界面。然后将剩余的水相与之混合，并继续按照协议操作。

b) 溶液SR5中的颗粒再悬浮

有机含量高的土壤类型可能会产生难以重新悬浮的RNA沉淀。将RNA沉淀在溶液SR5中加热至45°C，有助于其重新悬浮。使用移液枪头破坏RNA沉淀并剧烈涡旋，同样有助于RNA的重新悬浮。在第14步将沉淀物应用于柱子之前，确保完全重新悬浮沉淀物非常重要。如果不能完全重新悬浮RNA沉淀，则会导致RNA通过减少的柱结合而损失，并且会导致柱流速降低。

c) 柱流

JetStar Mini Columns适用于重力流动，不应与离心或真空力一起使用。可以使用5毫升注射器筒对柱子施加额外的正压。将5毫升注射器筒紧贴在JetStar MiniColumns的顶部，并轻轻推动注射器，使空气通过柱子。流速不得超过每秒1滴。

d) RNA的DNA污染

DNA的残留通常不会出现在大多数土壤类型中。然而，某些富含有机物的土壤可能会出现特殊的残留情况。可以通过琼脂糖凝胶分析或使用合格引物对分离的RNA进行PCR来检测纯化RNA中的潜在DNA残留，而无需先进行逆转录扩增。如果琼脂糖电泳未检测到扩增片段，则表明没有可检测的残留DNA。如果检测到了DNA，建议对分离的RNA进行DNase处理。

为了从RNA制备物中去除基因组DNA，我们推荐使用DNase Max。® 试剂盒（产品编号15200-50)。DNase Max试剂盒采用高速DNase酶，该酶在消化后通过树脂高效去除，树脂可使酶失活并与其结合。RNA从DNA中纯化，无需使

用抑制剂（如EDTA）或加热处理，即可直接使用。

e) 来自同一色谱柱的多个洗脱液

使用JetStar Mini Columns时，不建议进行超出协议要求的多次洗脱。虽然使用RNeasy PowerSoil DNA Elution Kit（产品编号12867-25)时，可能会有少量额外的RNA或DNA从柱子上洗脱下来，但这些物质中的抑制剂也会开始从柱子上被洗脱下来，可能会影响后续的应用。

 

附录A：使用苯酚/氯仿/isoamyl alcohol

苯酚和氯仿有毒，可能对您的健康和安全造成危害。在使用这些化合物前，请务必阅读所有制造商的警告和注意事项。

苯酚和苯酚/氯仿/isoamyl alcohol容易发生氧化反应，导致它们变成黄色或粉红色，这表明苯酚已不适合用于RNA提取。使用有色的苯酚或有色的苯酚/氯仿/isoamyl alcohol会降低RNA提取的质量。每次使用前，应取样检查。

苯酚/氯仿/isoamyl alcohol应置于透明容器中，以观察其澄清度和颜色。不使用时，需密封瓶盖，并在2°-8°C的阴凉环境中储存。避免长时间暴露于光照下。

制备苯酚/氯仿/isoamyl alcohol溶液

将25份苯酚、24份氯仿和1份isoamyl alcohol混合。此溶液可在TE缓冲液（10 mM Tris，1 mMEDTA，pH 8.0)或0.1 M Tris（pH 8.0)中储存，温度控制在2°–8°C，最长可达3个月。储存时请置于棕色瓶中以避免光照。如果在TE缓冲液中储存，我们建议您添加少量Tris缓冲液。

注意：氯仿与苯酚混合，以减少DNA和RNA在苯酚/水界面的损失，从而提高核酸提取的效率。氯仿能使蛋白质变性，并有助于去除脂质；isoamyl alcohol则能减少提取过程中的泡沫产生，同时有助于水相和有机相的分离。

 

附录B：从JetStar Mini柱中分离DNA

从JetStar Mini Columns洗脱RNA后，也可使用RNeasy PowerSoil DNA Elution Kit（货号：12867-25)从同一柱中洗脱DNA。该试剂盒提供了DNA分离所需的所有材料。

开始前的重要事项

●始终佩戴不含RNase和DNase的手套。

●开始前，从工作台面清除RNase和DNase。

程序

1. 将RNeasy PowerSoil总RNA试剂盒第16步的JetStar Mini柱转移至15 ml收集管（提供）中。

2. 向JetStar Mini柱中加入1 mL溶液SR8，将结合的DNA洗脱至15 ml收集管。使溶液SR8重力流入收集管中。

3. 将洗脱的DNA转移至提供的2.2毫升收集管中，并加入1毫升溶液SR4。充分振荡至少一次以确保混合均匀，然后在-15°C至-30°C的温度下孵育10分钟。

4. 在室温下以13,000 x g离心2.2 ml收集管15分钟，使DNA沉淀。

5. 倾析上清液，将2.2 mL收集管倒置在纸巾上10分钟，使DNA沉淀风干。

6. 将DNA沉淀物重新悬浮于100微升溶液SR7中。

注：虽然大多数土壤类型不会出现RNA残留，但某些有机物含量高的土壤可能会出现独特的残留情况。当RNA污染的缺失是关键时，建议对分离的DNA进行RNase处理；请参阅手册中的故障排除指南获取说明。

 

储存；储备

RNeasy PowerSoil 总 RNA 试剂盒试剂和成分应储存在室温（15-25摄氏度）下。