丙tong酸激酶Pyruvate kinase，PK试剂盒

丙tong酸激酶Pyruvate kinase，PK试剂盒、
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。

测定原理：
PK催化磷酸烯醇式丙tong酸和ADP生成ATP和丙tong酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙tong酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水



试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存;
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；； 
试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存； 
试剂三：液体25μL×2支，4℃保存； 

样本的前处理：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）试剂二的配制：临用前取试剂二一瓶，加入22.5mL试剂一和2.65mL蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用。
（2）试剂三的配制：临用前取试剂三一支，加入1.5mL蒸馏水充分溶解待用；现配现用。
（3）在1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂三和900μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

丙tong酸激酶Pyruvate kinase，PK试剂盒
PK活性计算：
1、血清（浆）中PK活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=2613×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PK活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2613×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=2613×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=5.226×ΔA
V反总：反应体系总体积，9.75×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。