β-半乳糖苷酶β-Galactosidase, β-GAL试

β-半乳糖苷酶β-Galactosidase, β-GAL试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 

测定意义：                           
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。

测定原理：
β-GAL分解对-硝ji苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝ji苯酚，后者在400nm有大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。

自备用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。



试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：

试剂名称（μL）	测定管	对照管
试剂一	200
蒸馏水		200
试剂二	250	250
样本	50	50

迅速混匀，放入37℃准确水浴30min

试剂三

1000

1000

充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。

β-半乳糖苷酶β-Galactosidase, β-GAL试剂盒
β-GAL活性计算：
标准条件下测定的回归方程为y =0.00543x -0.0027；x为标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol对-硝ji苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol对-硝ji苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/min /g鲜重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol对-硝ji苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V反总]÷(500×V样÷V样总)÷T =0.123×(ΔA +0.0027)
（4）按液体体积计算：
单位的定义：每mL液体样本每分钟产生1nmol对-硝ji苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/min /mL)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V反总]÷V样÷T=61.39×(ΔA+0.0027) 
V反总：反应体系总体积，0.5mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，30min。