胞浆异柠檬酸脱氢酶ICDHc试剂盒

 
胞浆异柠檬酸脱氢酶ICDHc试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
 
测定意义：
ICDHc（EC 1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸，同时还原NADP+生成NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

测定原理：
利用ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应，在340 nm下测定NADPH浓度的增加。

所需的仪器和用品:
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。



试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体50 mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支，4℃保存；
试剂三：粉剂×1支，4℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；

样本的前处理： 
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、将试剂二转移至试剂一中充分溶解，置于37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）水浴中预热10min左右；用不完的试剂4℃保存。
3、在试剂三中加入550μL蒸馏水充分溶解，置于37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）水浴中预热10min左右；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
4、在试剂四中加入550μL蒸馏水充分溶解，置于37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）水浴中预热10min左右；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
5、操作表：

试剂名称（μL）	测定管
试剂一	750
试剂三	10
试剂四	10
样本	30

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，加样本的同时开始计时；混匀，在340nm波长下记录20s时的初始吸光度A1和2min20s时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：
1、若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
2、若A2-A1小于0.005，可延长反应时间到5min或10min。
ICDHc活力单位的计算：
1、血清（浆）ICDHc活力的计算:
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=2143×ΔA
2、组织、细菌或细胞中ICDHc活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=2143×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=2143×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（nmol/min /104）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=4.285×ΔA
V反总：反应体系总体积，8×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。