硝酸还原酶Nitrate Reductase，NR活性测定试

硝酸还原酶Nitrate Reductase，NR活性测定试剂盒
分光光度法 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。

测定原理：
NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨ji苯磺酸及 α - 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有大吸收峰，可用分光光度法测定。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。



试剂的组成和配制：
诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。
试剂二：液体8mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存，（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；
试剂四：液体15mL×1瓶，4℃保存。    
试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。

诱导剂应用液的配制：
用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。
0.1μmol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。
样品的前处理
动植物组织样品的前处理：
（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。
（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

注 意：
1、建议使用新鲜没有冷冻过的样本。
2、一般不要诱导处理，预测定结果没有活性（A测定管≤A对照管）则需要诱导处理。
细菌或培养细胞的前处理：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在EP管中加入下列试剂）

试剂名称（μL）	加样孔
	测定管	对照管	标准管	空白管
样本	100	100
0.1μmol/mL标准液			100
蒸馏水		375		475
试剂一	375		375
试剂二	125	125	125	125

     混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴30min

试剂三	250	250	250	250
试剂四	250	250	250	250

混匀，25℃室温显色20min， 540nm下比色

注 意：
1、标准管和空白管只需测一次，每个测定管设一个对照管。
2、诱导处理后的样本对照管中试剂二改成加125μL蒸馏水。

硝酸还原酶Nitrate Reductase，NR活性测定试剂盒
NR活性计算：
（1）按样本鲜重计算：
单位定义：每小时每g鲜重样品中催化产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。
NR（μmol/h/g 鲜重）= (C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每小时每mg组织蛋白催化产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。
NR（μmol/h/mg prot）= (C标准管×V1)×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
C标准管：标准管浓度，0.1μmol/mL；V1：加入样本体积：0.1mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。