pmCherry-EGFP-LC3b-m哺乳自噬质粒

基本信息
名称：pmCherry-EGFP-LC3b-m哺乳自噬质粒
别称: pmCherry-EGFP-LC3b(mouse)

启动子:	CMV
复制子:	pUC
终止子:	SV40 poly(A) signal
质粒分类:	哺乳细胞，自噬表达载体
质粒大小:	5887bp
原核抗性:	Kan
筛选标记:	G418
克隆菌株:	DH5a
培养条件:	37度
表达宿主:	哺乳细胞
诱导方式:	无须诱导，瞬时表达
5'测序引物:	pEGFP-C-5:CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
3'测序引物:	根据序列设计引物

质粒属性

载体宿主：	哺乳细胞
载体用途：	蛋白表达,自噬
基因种属：	小鼠
基因类型：	ORF
原核抗性：	Kan
真核抗性：	Neo/G418
荧光蛋白：	绿色,红色

质粒简介
 

质粒图谱


质粒序列
OCUS       Exported                5887 bp ds-DNA     circular SYN 22-SEP-2016
DEFINITION  synthetic circular DNA
ACCESSION   .
VERSION     .
KEYWORDS    pmCherry-GFP-LC3（m）
SOURCE      synthetic DNA construct
  ORGANISM  synthetic DNA construct
REFERENCE   1  (bases 1 to 5887)
  AUTHORS   .
  TITLE     Direct Submission
  JOURNAL   Exported Thursday, September 22, 2016 from SnapGene Viewer 3.2.1
            http://www.miaolingbio.com
FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..5887
                     /organism="synthetic DNA construct"
                     /mol_type="other DNA"
     enhancer        61..364
                     /note="CMV enhancer"
                     /note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
     promoter        365..568
                     /note="CMV promoter"
                     /note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early 
                     promoter"
     CDS             613..1320
                     /codon_start=1
                     /product="monomeric derivative of DsRed fluorescent protein
                     (Shaner et al., 2004)"
                     /note="mCherry"
                     /note="mammalian codon-optimized"
                     /translation="MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEG
                     TQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNF
                     EDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALK
                     GEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERA
                     EGRHSTGGMDELYK"
     CDS             1342..2058
                     /codon_start=1
                     /product="enhanced GFP"
                     /note="EGFP"
                     /note="mammalian codon-optimized"
                     /translation="MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTL
                     KFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDD
                     GNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIK
                     VNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLL
                     EFVTAAGITLGMDELYK"
     misc_feature    2137..2516
                     /note="LC3B"
     polyA_signal    2675..2796
                     /note="SV40 poly(A) signal"
                     /note="SV40 polyadenylation signal"
     rep_origin      complement(2803..3258)
                     /direction=LEFT
                     /note="f1 ori"
                     /note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow 
                     indicates direction of (+) strand synthesis"
     promoter        3285..3389
                     /gene="bla"
                     /note="AmpR promoter"
     promoter        3391..3748
                     /note="SV40 promoter"
                     /note="SV40 enhancer and early promoter"
     rep_origin      3599..3734
                     /note="SV40 ori"
                     /note="SV40 origin of replication"
     CDS             3783..4577
                     /codon_start=1
                     /gene="aph(3')-II (or nptII)"
                     /product="aminoglycoside phosphotransferase from Tn5"
                     /note="NeoR/KanR"
                     /note="confers resistance to neomycin, kanamycin, and G418 
                     (Geneticin(R))"
                     /translation="MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRP
                     VLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLS
                     SHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPAT-CPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQ
                     GLAPAELFARLKASMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIA
                     LATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF"
     polyA_signal    4809..4856
                     /note="HSV TK poly(A) signal"
                     /note="herpesvirus thymidine kinase polyadenylation signal"
     rep_origin      5185..5773
                     /direction=RIGHT
                     /note="ori"
                     /note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of 
                     replication"
ORIGIN
        1 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg
       61 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt
      121 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca
      181 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc
      241 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta
      301 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac
      361 catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg
      421 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg
      481 ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt
      541 acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta
      601 ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat caaggagttc
      661 atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc
      721 gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt gaccaagggt
      781 ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg ctccaaggcc
      841 tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc cgagggcttc
      901 aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac ccaggactcc
      961 tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa cttcccctcc
     1021 gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga gcggatgtac
     1081 cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa ggacggcggc
     1141 cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca gctgcccggc
     1201 gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta caccatcgtg
     1261 gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga gctgtacaag
     1321 tccggactca gatctcgagg catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg
     1381 cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag
     1441 ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag
     1501 ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc
     1561 cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac
     1621 gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg
     1681 aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag
     1741 gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc
     1801 atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag
     1861 gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc
     1921 gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac
     1981 gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc
     2041 atggacgagc tgtacaagta ctcagatctc gagctcaagc ttcgaattct gcagtcgacg
     2101 gtaccgcggg cccgggatcc accggatcta gataacatgc cgtccgagaa gaccttcaag
     2161 cagcgccgga gctttgaaca aagagtggaa gatgtccggc tcatccggga gcagcacccc
     2221 accaagatcc cagtgattat agagcgatac aagggggaga agcagctgcc cgtcctggac
     2281 aagaccaagt tcctggtgcc tgaccacgtg aacatgagcg agctcatcaa gataatcaga
     2341 cggcgcttgc agctcaatgc taaccaagcc ttcttcctcc tggtgaatgg gcacagcatg
     2401 gtgagtgtgt ccactcccat ctccgaagtg tacgagagtg agagagatga agacggcttc
     2461 ctgtacatgg tttatgcctc gcaggagaca ttcgggacag caatggctgt gtaggaattc
     2521 tgcagtcgac ggtaccgcgg gcccgggatc caccggatct agataactga tcataatcag
     2581 ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa
     2641 cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg
     2701 ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc
     2761 tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttaacgc gtaaattgta agcgttaata
     2821 ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg
     2881 aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc
     2941 cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa
     3001 ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt
     3061 cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac
     3121 ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta
     3181 gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg
     3241 cgccgctaca gggcgcgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt
     3301 gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa
     3361 tgcttcaata atattgaaaa aggaagagtc ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt
     3421 gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat
     3481 gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag
     3541 tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat
     3601 cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt
     3661 tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg
     3721 cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaga tcgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc
     3781 gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat
     3841 tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt
     3901 cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac
     3961 tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg
     4021 tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc
     4081 aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa
     4141 tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc
     4201 gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg
     4261 aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg agcatgcccg
     4321 acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa
     4381 atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg
     4441 acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct
     4501 tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc
     4561 ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa
     4621 cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat
     4681 cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt
     4741 cgcccaccct agggggaggc taactgaaac acggaaggag acaataccgg aaggaacccg
     4801 cgctatgacg gcaataaaaa gacagaataa aacgcacggt gttgggtcgt ttgttcataa
     4861 acgcggggtt cggtcccagg gctggcactc tgtcgatacc ccaccgagac cccattgggg
     4921 ccaatacgcc cgcgtttctt ccttttcccc accccacccc ccaagttcgg gtgaaggccc
     4981 agggctcgca gccaacgtcg gggcggcagg ccctgccata gcctcaggtt actcatatat
     5041 actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt
     5101 tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc
     5161 cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt
     5221 gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac
     5281 tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt
     5341 gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct
     5401 gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga
     5461 ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac
     5521 acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg
     5581 agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt
     5641 cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc
     5701 tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg
     5761 gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc
     5821 ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc
     5881 catgcat
//
 

质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
         收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
         1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
              ①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
              ②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
              ③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
              ④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
              ⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
              ⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
        2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
              四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
        3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
              穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
        4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
              直接挑取单菌落至液体培养基中。
        5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
              单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
        6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
              收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。

二、转化图片

P3252/pENTR223-CD99（1同义突变）人源基因质粒

P3253/pENTR223-ADRM1（2同义突变）人源基因质粒

P3254/pENTR223-NFIC人源基因质粒

P3255/pENTR223-IGK人源基因质粒

P3256/pENTR223-RND3人源基因质粒

P3257/pENTR223-NDUFAF1人源基因质粒

P3258/pENTR223-BUB3人源基因质粒

P3259/pENTR223-MELTF(1同义突变）人源基因质粒

P3260/pENTR223-HAGHL人源基因质粒

P3261/pENTR223-FAM49B人源基因质粒