细胞自噬发生与检测
和元生物
19984
过去十年，几乎每个生命科学者都知道“凋亡”这个概念且有意无意地将自己的研究工作与之挂钩，催生了大量文章。同样我们有理由坚信未来十年“自噬”也会变成另一个“万金油”和生命科学的“闪亮新星”。下面将为大家介绍“自噬”的精彩内容。
细胞自噬：
自噬（Autophagy）是普遍存在于真核细胞中的一种高度保守的代谢过程，是细胞内的一种“自食（Self-eating）”现象。它作为细胞内的主要降解途径，将胞内物质运输到溶酶体内降解。它主要有三种形式：大自噬，小自噬和分子伴侣介导的自噬。
自噬（Autophagy）是普遍存在于真核细胞中的一种高度保守的代谢过程，是细胞内的一种“自食（Self-eating）”现象。它作为细胞内的主要降解途径，将胞内物质运输到溶酶体内降解。它主要有三种形式：大自噬，小自噬和分子伴侣介导的自噬。
自噬发生与调节：
自噬的诱导主要由 ULK1、FIP200、Atg13 三种蛋白形成的ULK1复合物与雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)之间相互作用实现的，成核过程与ClassIII PI3K(Vps34)-Beclin-1 复合物密切相关。自噬体在延伸阶段主要依赖于两个泛素化复合系统，即 Atg12 的结合过程与 LC3 的修饰过程，且都需要泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架，在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体 GTP 酶(RabS)作用下与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程，有些溶酶体相关蛋白也参与了其中，包括 LAMP1、LAMP2、UVRAG (紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因）。而在降解阶段自噬体蛋白也发挥了重要作用，如 Atg22、Atg12、Atg15、Atg1、Atg13 等。细胞自噬的调节是一个多步骤的极其复杂的过程，目前机制尚未完全掌握，已知它主要是通过mTOR 信号通路、Beclin-1 信号通路、P53 信号通路三条途径来进行调控的。
自噬的诱导主要由 ULK1、FIP200、Atg13 三种蛋白形成的ULK1复合物与雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)之间相互作用实现的，成核过程与ClassIII PI3K(Vps34)-Beclin-1 复合物密切相关。自噬体在延伸阶段主要依赖于两个泛素化复合系统，即 Atg12 的结合过程与 LC3 的修饰过程，且都需要泛素活化酶 E1 和 E2 的参与。自噬体的成熟主要是指自噬体通过微管骨架，在转运必须内吞体分类复合物(ESCRT)和单体 GTP 酶(RabS)作用下与溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程，有些溶酶体相关蛋白也参与了其中，包括 LAMP1、LAMP2、UVRAG (紫外线抵抗相关肿瘤抑制基因）。而在降解阶段自噬体蛋白也发挥了重要作用，如 Atg22、Atg12、Atg15、Atg1、Atg13 等。细胞自噬的调节是一个多步骤的极其复杂的过程，目前机制尚未完全掌握，已知它主要是通过mTOR 信号通路、Beclin-1 信号通路、P53 信号通路三条途径来进行调控的。
1） mTOR 信号通路：mTOR 是是一个丝/苏氨酸蛋白激酶，能接受多种上游信号，如 Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化。mTOR 存在两种不同形式：对雷帕霉素敏感的 mTOR 复合物1（mTOR1）和对雷帕霉素不敏感的 mTOR 复合物2（mTOR2）。
2）Beclin-1 信号通路：Beclin-1 是酵母自噬基因 Atg6/Vps30 的同源基因，能与多种蛋白结合，如 Vps34（Class III PI3K 的催化亚单位），mTOR，BCL-2 和 BCLXL 蛋白等，beclin-1 是一个多功能蛋白，除了接受自噬信号，它还可以接受很多其它的信号对自噬进行调节。
3） P53 信号通路：在细胞核中，P53 能与多种蛋白作用，如 sestrin1/2 蛋白、DAPK1、BCL-2 家族、DRAM1 等作用，发挥上调细胞的自噬水平功能。而在细胞质中，P53 能够发挥抑制细胞自噬水平的功能。
自噬检测：
LC3 是自噬标志物，自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即 LC3-II），LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。LC3 这一转变过程可被 Western Blot 和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。在哺乳动物中，LC3 包含 3 种亚型：LC3A、LC3B、LC3C，分布在不同的组织中，因此需要用不同的抗体去鉴定这3种亚型。
LC3 是自噬标志物，自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即 LC3-II），LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。LC3 这一转变过程可被 Western Blot 和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。在哺乳动物中，LC3 包含 3 种亚型：LC3A、LC3B、LC3C，分布在不同的组织中，因此需要用不同的抗体去鉴定这3种亚型。
和元生物能够提供成熟的细胞自噬相关的技术服务
GFP-LC3 单荧光自噬指示体系：
利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象构建了 GFP-LC3 指示体系，无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：
mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒产品 mRFP 用于标记及追踪 LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体。由于 GFP 荧光蛋白对酸性敏感(pH 敏感)，当自噬体与溶酶体融合后 GFP 荧光发生淬灭,而 mRFP 相对稳定，因此只能检测到红色荧光。
利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象构建了 GFP-LC3 指示体系，无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：
mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒产品 mRFP 用于标记及追踪 LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体。由于 GFP 荧光蛋白对酸性敏感(pH 敏感)，当自噬体与溶酶体融合后 GFP 荧光发生淬灭,而 mRFP 相对稳定，因此只能检测到红色荧光。
1. 哺乳动物 LC3 表达质粒
plenti-CMV-EGFP-LC3 质粒
plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 质粒
plenti-CMV-EGFP-LC3 质粒
plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 质粒
2. LC3 细胞自噬病毒
plenti-CMV-EGFP-LC3慢病毒
plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 慢病毒
plenti-CMV-EGFP-LC3 腺病毒
plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 腺病毒
plenti-CMV-EGFP-LC3慢病毒
plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 慢病毒
plenti-CMV-EGFP-LC3 腺病毒
plenti-CMV-mRFP-EGFP-LC3 腺病毒
文献支持（部分）
1. Autophagy 10:10, 1-13; October 2014
Endoplasmic reticulum stress induced by tunicamycin and thapsigargin protects against transient ischemic brain injury Involvement of PARK2-dependent mitophagy
2. Autophagy 10:6, 972-985; June 2014
Small molecule-driven mitophagy-mediated NLRP3 inflammasome inhibition is responsible for the prevention of colitis-associated cancer
Endoplasmic reticulum stress induced by tunicamycin and thapsigargin protects against transient ischemic brain injury Involvement of PARK2-dependent mitophagy
2. Autophagy 10:6, 972-985; June 2014
Small molecule-driven mitophagy-mediated NLRP3 inflammasome inhibition is responsible for the prevention of colitis-associated cancer
3. Autophagy: 25 April 2015
Small molecule-driven mitophagy-mediated NLRP3 inflammasome inhibition is responsible for the prevention of colitis-associated cance
