支原体qPCR检测试剂盒(探针法)

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格（元）	促销价（元）
MycAway™ Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit   支原体qPCR检测试剂盒（探针法）	40618ES05	5 T	855	595
	40618ES25	25 T	4155	3155
	40618ES60	100 T	13855	10355

产品描述

MycAway™ Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit 作为精确支原体检测试剂盒，可用于确定如细胞库、病毒种子、临床治疗用途的细胞和生物制品中是否存在支原体污染。本试剂盒采用荧光探针qPCR法技术，定性检测待测样本中支原体DNA，可覆盖100多种支原体DNA序列；具备高灵敏、高特异、高效率、安全高等优势，严格按照EP2.6.7和JPXVII支原体检测相关标准要求进行验证。

本试剂盒包含内部质控（IC），可用来判断待检样本中是否包含对扩增反应存在抑制的因素，从而达到防止假阴性结果的产生；内部质控（IC）也可在样本提取阶段加入，以评估提取效果。本试剂盒与支原体DNA提取纯化试剂盒配套使用，高效提取样本中的支原体DNA，检测限可达到10 CFU/mL，最高灵敏度可达1 CFU/mL。

产品组分

编号	组分	产品编号/规格
		40618ES05 (5T)	40618ES25 (25 T)	40618ES60 (100 T)
40618-A	4×MyqPCR Reaction Buffer	50 μL	250 μL	1 mL
40618-B	MyPrimer&Probe MIX	5 μL	25 μL	100 μL
40618-C	内部质控（IC）	5μL	25 μL	100 μL
40618-D	阳性质控（PC）	100 μL	500 μL	2 mL

【注】：阳性质控（PC）浓度为1000copies/µL。

运输储存方法
 

干冰运输。-20℃保存，有效期一年。

注意事项
 

1）使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2）加样和配液步骤都尽量在冰上操作。

3）每个组分在使用前都应震荡混匀，低速离心。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途。

适用机型
 

PRISM^® 7500Real-Time PCR System、QuantStudio™ 5（ABI）；CFX96（Bio-Rad）

实验设计
 

一、待测样本DNA提取

建议使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit提取样本DNA。

二、qPCR反应体系的准备

1）根据所要检测样本的数量，计算所需反应孔数，一般做2个重复孔。

反应孔数=（1个阳性质控PC+1个无模板对照NTC+N个待测样本）×2

2）根据表1反应体系，将所需试剂放冰上融化。

3）根据反应孔数计算所需要的qPCR Mix的量。

Mix=（反应孔数+2）*（10+1+1+8）（包含加样损失）

表1. 反应体系（以40 μL为例）

组分	单孔体积（μL）	终浓度
4× MyqPCR Reaction Buffer （40618-A)	10	1×
待测样本DNA/阳性质控	20
MyPrimer&Probe MIX (40618-B)	1	0.4 μM
IC (40618-C)	1
超纯水	8
Total	40

【注】：

1）为保证实验的稳定性，40618-A、40618-B组分需储存于-20℃。

2）为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将40618-C、40618-D分装储存于-80℃。

3）qPCR Mix配制过程不加待测样本DNA与阳性质控。

三、加样

1）充分震荡混匀qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。

2）向每孔反应管中分装20μL qPCR Mix。

3）向已分装过qPCR Mix的反应管中加入样品，示例如下：
 

表2. 加样示例

待测样本DNA	20 μL qPCR Mix+20 μL 待测样本DNA
NTC对照	20 μL qPCR Mix+20 μL DNA Elution Buffer （或者ddH2O）
阳性质控（PC）	20 μL qPCR Mix +20 μL 阳性质控

【注】：此时每个反应孔的体积为40μL

4）盖上反应管盖子或者贴上光学膜，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。

5）反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底；充分震荡混匀后，再短时低速离心，将管盖和管壁的残留液体收集至底，如有气泡，需将气泡排尽。
 

qPCR程序参数设置
 

1、创建目的通道探针：

创建目的通道的FAM探针，选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为none；

创建IC 通道的VIC探针，选择报告荧光基团为VIC，猝灭荧光基团为none；

选择检测参比荧光为ROX（可选择，试剂盒中不含）。

2、标准扩增程序：

	反应阶段	温度	时间	循环数
1	预变性	95℃	5 min	1
2	扩增反应	95℃	15 sec	45
		62℃*	30 sec

【注】：* 荧光信号采集。

结果分析
 

1、PC、NTC结果判断:

质控样本	FAM 信号	VIC 信号
PC	Ct<40 ,且有明显的扩增曲线。	Ct<40 ,且有明显的扩增曲线。
NTC	Ct≧40 ,或无明显的起峰	Ct≧40 ,或无明显的起峰

2、待测样本检测结果判定：

FAM 信号	VIC 信号	结果判断
Ct<40 ,且有明显的扩增曲线	Ct<40 ,且有明显的扩增曲线	阳性
	Ct≧40 ,或无明显的起峰	有抑制
Ct≧40 ,或无明显的起峰	Ct<40 ,且有明显的扩增曲线	阴性
	Ct≧40 ,或无明显的起峰	有抑制

【注】：*VIC信号如果有抑制，需重测或对样本进行合适处理消除抑制因子
HB210901