- ￥1200
- 晶风生物
- 中国
- TF16696
- 2025年07月03日
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- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
三个月
- 英文名：
pBI-wrky15-RNAi质粒载体
- 库存：
10
- 供应商：
晶风生物
- 规格：
约0.5ug
产品规格：0.5ug质粒干粉（实际规格可能会有出路，具体规格价格请和客服核实）
亲爱的科研工作者，感谢您信任晶风生物，我们致力于为大家分享质优价适的质粒，受各种因素影响，我们只保证质粒的关键序列测序正确，不能保证实验效果。请您收到质粒后请务必先转化，再挑取单菌落扩增，不要直接使用。如果您需要即用的大包装质粒或病毒颗粒，可委托我们制备，性价比更高。
pBI-wrky15-RNAi质粒载体扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h，（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
转化图片：
pBI-wrky15-RNAi质粒载体提取步骤：（本步骤仅做示例，非该产品实际提取步骤）
实验原理：
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH 4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA ，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、操作步骤：
1. 准备20ml灭菌过的培养管，编号，分别加入8ml LB培养基，再加入8µl 相应抗生素，可适量多加；
2. 用10µl 白色枪头挑取挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡过夜（274rpm）；
3. 取2ml过夜培养的菌液加入离心管中，室温10000rpm离心2min，去上清；（可重复步骤2，直至菌液离心完）（去上清时用纸吸一下）
4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl Buffer P1（含RNase A），使用移液枪充分混匀，悬浮菌体菌体；
5. 向离心管中加入250µl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4~6次，获得澄清的裂解液；（剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度）
6. 向离心管中加入350µl Buffer N3， 立即温和地上下颠倒混匀4~6次，此时出现白色絮状沉淀。室温10000rpm离心15min；
7. 小心将步骤6中所得的上清液转移至洁净的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000rpm离心1min，至裂解物完全通过吸收柱,倒掉收集管中的废液；
8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
9. 向吸附柱中加400µl Buffer PW（检查是否加入无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。再空离一次，2min（此时可以加热 Buffer EB，65~70℃）；
10. 将吸附柱置于一个新的离心管中，打开盖子，吹风4min左右（确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤）；
11. 向吸附柱的吸附膜中间部位加90µl Buffer EB（pET系列拷贝数低，加EB 70μl即可），室温静置2min。10000rpm离心1min；
12. 把液体倒回吸附柱，在10000rpm离心1min；
13. 混合质粒至一个离心管中，做好标记，开盖室温放置两小时左右。-40℃保存质粒。
三、注意事项：
1.使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。
2.Buffer EB在65~70℃水浴预热，可以增加提取效率。
更多质粒载体，请咨询我公司：pBI-wrky15-RNAi质粒载体
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文献和实验比 RNAi 的效果更好。所以大多数研究人员开始使用以 AA 开始的 19 碱基作为 siRNA 的目的序列，文献上会写成 AA+19. 根据这些文献的资料 [AA+19+2 延伸的悬突体（合计 23 碱基），合成双联 siRNA 时，合成出的序列会和文献上记载的不同。 （1）Nature , 411, 494-498, 2001 （2）EMBO J., 20, 6877-6888, 2001 （3）Genes Dev., 15, 188-200, 2001
重复序列、反义 RNA 技术 [13]、基因过量表达（共抑制），都能在植物中引发 PTGS。进一步研究表明，在植物和无脊椎动物中，引发 RNAi 的作用元件是小分子的双链 RNA (smallinterfering RNA, siRNA) [4, 14, 15]，而它是在细胞质中由 Dicer 酶 [ 15] 降解 dsRNA 产生的。siRNA长度为 21~22 nt，其 3' 端含有 2 个游离未配对的核苷酸。Dicer 识别 dsRNA 并从两端将其切断，形成 siRNA。在植物和动物中
shRNA制备的其他方法，将极有可能取代常规病毒表达shRNA的方法成为最佳的RNA干扰技术。 6．PCR制备shRNA表达框生产siRNA 优点：成本较低，方便快捷，可以用于有效序列的筛选，可以用于质粒载体构建。 缺点：转染效率低，不适合大规模制备。 适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子 不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了） 评价：★★★☆☆ 晶赛公司推荐给您的RNAi实验方法的参考模式： 1． 确立需要干扰的目标基因 2． 检查使用细胞的转染
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