F. 在约520微升样品中加入10微升0.5M EDTA,20微升1M Tris pH 6.5和1微升20mg/ml 蛋白酶K。混匀后45℃孵育60分钟。
G. 加入等体积Tris平衡苯酚,vortex剧烈混匀,随后4℃,12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。
H. 加入等体积氯仿,vortex剧烈混匀,随后4℃,12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。
I. 加入20微克glycogen或yeast tRNA,加入1/10体积的3M NaAc,pH5.2,再加入2.5倍体积无水乙醇。混匀后-70℃沉淀不少于1小时,或-20℃沉淀8小时以上。
J. 4℃,12000-14000g离心10分钟,小心吸去大部分上清,切勿触及沉淀。
K. 加入约1ml 70%乙醇洗涤沉淀。4℃,12000-14000g离心10分钟,小心吸去大部分上清,切勿接触沉淀。
L. 4℃,12000-14000g离心1分钟,非常小心地吸除残留液体。
M. 用少量TE或水重悬DNA沉淀,用于目的基因的PCR检测。用于PCR的引物最好能设计2组,可以用Input作为模板预先摸索出相应的PCR条件,并选择一组效果较好的引物用于最终的PCR检测。少数情况下,当PCR条带过弱时,可以采用nested PCR技术,进行两轮扩增。
说明:步骤G至步骤M也可以采用适当的DNA纯化试剂盒纯化DNA,例如碧云天的PCR/DNA纯化试剂盒(D0033)。
4. Western检测ChIP产物(如果ChIP产物用于Western检测):
A. 接步骤2H,在完成所有的洗涤步骤后,加入25微升SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)。SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)可以用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)用水稀释配制而成。沸水浴煮沸10分钟。
B. 可以取10-20微升用于Western检测