四、使用说明:
1. 样品超声处理条件的优化:
A. 准备适量冰浴预冷的PBS,以及100mM PMSF。将SDS Lysis Buffer适当温浴,使其中的SDS充分溶解,并混匀。
B. 将细胞培养于10cm细胞培养皿中,细胞培养液的用量为10 ml。在预期发生目的蛋白和基因组DNA结合的时间点,直接在细胞培养液中加入适量甲醛,轻轻混匀,至最终浓度为1%。随即在37℃孵育10分钟,以交联目的蛋白和相应的基因组DNA。例如,对于常规的每个10cm细胞培养皿中加入10 ml细胞培养液的情况,需加入270微升37%甲醛。请注意尽量使用高质量的在有效使用期限内的甲醛。细胞也可以培养于6cm细胞培养皿中,相关溶液的用量需按照比例进行相应调整。
C. 加入1.1ml Glycine Solution (10X),轻轻混匀。室温放置5分钟。
D. 将有细胞样品的培养皿置于冰浴上。吸尽含甲醛和glycine的培养液,尽量保持没有液体残留。
E. 在上述室温放置5分钟期间,用冰浴预冷的PBS稀释100mM PMSF至1mM,即配制成冰浴预冷的含1mM PMSF的PBS。PMSF水性溶液一定要新鲜配制,其在水相中的半衰期约为30分钟。
F. 加入5-10ml冰浴预冷的含1mM PMSF的PBS,洗涤细胞,吸尽液体,尽量保持没有液体残留。
G. 再加入5-10ml含冰浴预冷的1mM PMSF的PBS,进一步洗涤细胞,吸尽液体,尽量保持没有液体残留。
H. 加入1ml冰浴预冷的含1mM PMSF的PBS,用细胞刮子刮下细胞,收集至离心管中。如果细胞可以用枪吹打下来,也可以用枪吹打。对细胞进行计数,分装成每管大约100万细胞。
I. 4℃,800-1000g离心1-2分钟,以充分沉淀细胞。如果发现沉淀不充分,可以适当延长离心时间。吸尽上清,尽量减少液体残留。
J. 配制适量含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer。上一步骤的100万细胞沉淀用0.2ml含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer重悬。
K. 在冰浴上孵育10分钟,以充分裂解细胞。
L. 超声处理,以剪切基因组DNA,使DNA大部分断裂成200-1000bp大小,如果能把大部分控制在400-800bp则更佳。超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中,并且处于较低温度。超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。超声处理的条件通常可以设置为10秒每次,共3-4次,功率为50W时设置为最大功率的30%,采用2mm超声头。不同的超声处理仪器的设置不太一样,摸索超声条件时,可以先固定其他条件,先确定每次超声多长时间不会导致明显发热,然后摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可以使大部分基因组DNA断裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定,否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。
M. 在0.2ml经过超声处理的样品中加入8微升5M NaCl,混匀。65℃加热4小时,以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。
N. 加入等体积的Tris平衡苯酚,vortex剧烈混匀,随后4℃,12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。
O. 加入等体积氯仿,vortex剧烈混匀,随后4℃,12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。
说明:上述步骤1N和1O的酚氯仿抽提可以使用DNA纯化试剂盒进行操作。例如碧云天的PCR/DNA纯化试剂盒(D0033)。
P. 取少量通过酚氯仿抽提或DNA纯化试剂盒获得的液体,对于酚氯仿抽提产物可以取5-10微升,对于DNA纯化试剂盒纯化产物可以取2-5微升,进行琼脂糖凝胶电泳,观察超声处理对于基因组DNA的剪切效果。