2. 染色质免疫沉淀:
A. 在对样品超声处理条件进行优化后,对于待检测样品按照步骤1A-1K进行操作,并参考步骤1L进行超声处理。
B. 随后对于经过超声处理的样品在4℃,12000-14000g离心5分钟。取上清(约0.2ml)至一2ml离心管中,置于冰浴。
C. 配制适量含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer。加入1.8ml含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer以稀释经过超声处理的样品,使最终体积为2毫升。
D. 取出20微升样品作为Input用于后续检测。其余近2ml样品加入70微升Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA(其中约35微升为沉淀,35微升为液体),在4℃缓慢转动或摆动混匀30分钟。此步骤的目的是减少Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特异性结合。
E. 4℃,1000g左右离心1分钟,将上清转移至一个新的2毫升离心管中。
F. 加入适量一抗,一抗的用量可以参考抗体的说明书。如果抗体的说明中未给出用于ChIP的稀释比例,可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例。通常一抗的用量为0.5-1微克。4℃缓慢转动或摆动混匀过夜。可以不加抗体作为阴性对照,或用无关的抗体作为阴性对照,同时可以用没有细胞样品的溶液作为空白对照。
G. 加入60微升Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA(其中约30微升为沉淀,30微升为液体),在4℃缓慢转动或摆动混匀60分钟,以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。
H. 4℃,1000g左右离心1分钟。非常小心地去除液体,切勿触及沉淀。随后依次用如下溶液对沉淀进行洗涤,每次洗涤液的用量为1ml,每次在4℃缓慢转动或摆动洗涤3-5分钟,随后4℃,1000g左右离心1分钟。非常小心地去除液体,切勿触及沉淀。
a. Low Salt Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。
b. High Salt Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。
c. LiCl Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。
d. TE Buffer洗涤两次。
说明:完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于PCR扩增目的基因序列或用Southern检测目的基因序列,或者用于Western检测等。
3. PCR扩增目的基因序列(如果ChIP产物用于检测目的基因序列):
A. 新鲜配制适量Elution buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3)。
B. 完成步骤2H后,即完成所有洗涤步骤后,加入250微升Elution buffer。Vortex混匀,室温转动或摆动继续洗脱3-5分钟。
C. 1000g左右离心1分钟,将上清转移到一新的离心管中。沉淀中再加入250微升Elution buffer。Vortex混匀,室温转动或摆动继续洗脱3-5分钟。
D. 1000g左右离心1分钟,取出上清。和上一步骤,即步骤3C中获得的上清合并。共计约500微升上清。
E. 在500微升上清中加入20微升5M NaCl,混匀。65℃加热4小时,以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。对于步骤2D获得的作为Input的20微升样品,加入1微升5M NaCl,混匀,65℃加热4小时,同样用于去除蛋白和基因组DNA之间的交联。此步骤完成后可以继续进行后续步骤,也可以先-20℃冻存,第二天继续后续步骤。
说明:此时的样品已经可以用于PCR,可以尝试使用1、2、5或10微升样品作为模板用于PCR检测目的基因。此时PCR的效果和可能被沉淀下来的DNA的量,以及整个PCR扩增体系是否容易扩增目的基因有关。如果发现PCR效果欠佳,可以考虑通过后续的纯化步骤,纯化并浓缩样品,然后再进行PCR检测。
注意:通常情况下,推荐进行后续纯化后再进行PCR检测,而Input通常不必进行后续纯化步骤。