氧化型MTT的吸收曲线
还原型的MTT吸收曲线
问:MTT用PBS配制,原先培养基中10%FBS会影响结果吗?
丁香网友chinaefulle认为:不会,因为上清会弃去,每一个孔中都平行有10%FBS,即使有影响,其影响的大小也是可以通过阴性对照扣除掉。
问:我一直在想一个问题,为什么网上见的protocol绝大部分都是MTT加10~20ul,然后放3~4h再测?是为了节省试剂?我想在某种程度上时间能更重要些,但为什么不增加MTT的量,减少孵育时间呢?从我的实验来看,增加MTT、降低孵育时间是可行的。但是现在也存在一个问题,就是即使用到5000/well,现在不加药的孔的OD也能到1.5甚至2以上。是否有MTT增加的原因?这个还在进行验证。希望有我这种实验经历和想法的同行一起讨论。
丁香网友chinaefulle认为:你提的这个问题很好,值得探索。但是目前都是约定加入10%体积的MTT,然后反应3-4h。我个人猜想可能与以下原因有关(纯属猜测,因为没做过实验):
1、根据我的经验,MTT的溶解度不是太好,所以0.5%的MTT母液(相当于10X)已经可能接近最大溶解极限,而直接用含血清的培养液配制因为带入的成分复杂,MTT保存的稳定性可能存在疑问。所以使用孵育3-4h的条件。
2、MTT是琥珀酸脱氢酶的人工底物,底物浓度过高可能导致酶抑制,当然,MTT是否有此作用值得实验验证,但大多数酶的底物浓度过高时会产生酶的抑制作用(直接的抑制作用)。
问:我的MTT是用PBS配的,5mg/ml,因为每孔的溶液量为100ul,所以我加了10ul。现在我的调零孔孵育4小时后为黄色,但是加入DMSO之后,还是红色的,490nm下的吸收值为0.2左右。难道是我买的培养基或是血清有问题,我用的是GIBCO的1640培养基,杭州四季青的血清。
丁香网友chinaefulle认为:
1、MTT温孵4h可能会发生自发的氧化还原作用而产生颜色。因为你是和培养基血清一起孵育的,你的空白孔470nm吸收在0.2左右,因该说是预期值,要减少它,在你的条件下只能靠减少反应时间。但是要注意你的“有细胞但不加药的孔”吸光度是多少,如果吸光度小,比如低于0.8,那么建议你增加细胞浓度。
2、尽量不要用延长反应时间来增加吸光度,因为MTT会自发转化,尤其是有血清的帮助下(血清中含有NADH、Fe3+等物质,这些物质能促进MTT转化),通过增加细胞数减少反应时间来提高检测孔和空白孔的相对差值是可行的,而通过增加反应时间可能很难凑效。这一点许多书上没说。
你除去培养基后是否在加入同体积的PBS。我曾经试过,把培养基吸出,然后加同体积的PBS,再加入MTT,测出的值要比有培养基可孔的值低,当时好像能低0.2左右(490nm)。
丁香网友山百合的做法是:去除培养基后,直接加用PBS稀释的MTT(MTT母液也是用PBS配制的)200微升,放置1h再加200微升的DMSO。
丁香网友chinaefulle认为:估计采用提高MTT浓度以减少孵育时间的做法可能不可行。仅供参考,理由如下:我们常规加入的MTT是过量的,反应4h后96孔板的溶液仍是黄色,改变较小,这表明MTT加入的量的确是过量的。过量的底物与酶反应实际上是零级动力学过程,即酶已经被底物饱和。如果再增加底物浓度实际上也改变不了一定时间内的产物量。也就是说,底物再增加10倍,要想获得原先的吸光度,以前用3h,现在可能还是要用将近3h。因此意义较小。当然,我用的是理论分析,应该以实验为依据。仅供你参考,如果能明显缩短反应时间那么还是很有意义的。