SDS-PAGE蛋白胶银染注意事项
银染注意事项:1. 银染主要出现在胶的表面,用薄胶(0.5-0.75mm)可以提高灵敏度。2. 对于考马斯亮蓝染色的胶,可用甲醇将胶漂洗后,继续进行银染。乙酸会干扰银染,因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染,可用Rapid Fix脱色,并用考马斯亮蓝二次染色。3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的,尤其是碱性蛋白染色效果差。因此,不宜用银染测定不同蛋白的比例。4. 染色过程中, ...
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凝胶柱层析关键的一环——如何选择凝胶填料
如何选择凝胶做分离纯化工作的人都知道,选择合适的填料是至关重要的。 1.测定------分子量、PI 当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时,可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中,可简易地测出PI,并选择纯化用缓冲液的最佳PH。 2.选 ...
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GST融合蛋白纯化方法
GST融合蛋白纯化方法 1目的片段接入pGEX载体; 2 涂板,挑单克隆,摇菌至OD600≈1.0,加入IPTG(终浓度1 mM)诱导6-8 h; 3 收菌,每升菌液约以50 mL PBS重悬,加入1%Triton X-100(v/v),1%β-巯基乙醇(v/v),PMSF(终浓度1 mM); 以下步骤均在冰上操作: 4 超声破碎菌体,15000 g,10min离心取上清,在上清中加入适量GST-beads,轻轻晃动令其吸附蛋白1 h; 5 2000 g,3min离心弃上清; 6 加入至少10倍体积PBS,轻摇至b ...
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如何判断竞争法、间接法和夹心法 ELISA 中的结果?
定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性,显色清晰者为阳性。但在 ELISA 中,正常人血清反应后常可出现呈色的本底,此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异,因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断结果时,更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。目视法简捷明了,但颇具主观性。在条件许可下,应该用比色计测定吸光值,这样可以得到客观的数据。先读出标本( ...
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