关键词: 蛋白 纯化 方法
来源: 互联网
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GST融合蛋白纯化方法
1 目的片段接入pGEX载体;
2 涂板,挑单克隆,摇菌至OD600≈1.0,加入IPTG(终浓度1 mM)诱导6-8 h;
3 收菌,每升菌液约以50 mL PBS重悬,加入1%Triton X-100(v/v),1%β-巯基乙醇(v/v),PMSF(终浓度1 mM);
以下步骤均在冰上操作:
4 超声破碎菌体,15000 g,10min离心取上清,在上清中加入适量GST-beads,轻轻晃动令其吸附蛋白1 h;
5 2000 g,3min离心弃上清;
6 加入至少10倍体积PBS,轻摇至beads悬浮于溶液中,2000 g,3 min离心弃上清;
7 重复步骤6 两次;
8 加入1 mL GST Elution Buffer,轻摇10 min;
9 2000 g,3 min离心,收集上清;
10 重复步骤8-9至少两次;
11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,Bradford法检测蛋白浓度;
12 将蛋白置于-20℃保存。
P.S. 大量提取前应取少量菌液,改变IPTG浓度,诱导温度,诱导时间等,以确定蛋白表达的最适条件。
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为什么同一批次提取蛋白跑出的条带不一致
做这个实验的时,我同一批次提取的蛋白,胶跑出的条带都不一致,这是什么原因呢?
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WB 敷牛奶需要的时间
Western Blot 实验时敷牛奶大概多久?一定要过夜吗
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WB发光结果异常
我做WB也不算是新手,自己觉得整个过程也没有什么明显的问题,可是最后发光的时候内参整个是晕开的,分子还连成了一条线,之前没出现过这种情况,所以想请大家帮忙分析下,是胶的问题,蛋白的问题,还是什么别的,谢啦!
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蛋白质分离纯化方法(威斯腾生物-中关村生物医学研发检测共享平台!)
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