RNA样品为XpressRefTM人总RNA(GA-004),起始RNA量分别为0.1,1.0,5,10,50,100和1000ng)。芯片为炎症细胞因子和受体PCR芯片(APHS-011A)。采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 荧光素PCR反应体系(PA-011)。阳性信号的比例(Ct<35的基因所占的百分比)与对应的总RNA量做图。
特异性
PCR芯片体系的设计和优化都是针对基于SYBR green的实时定量PCR反应。由于SYBR Green与非特异的双链DNA也会发生反应,为了获得高特异性,需要保证引物只扩增出特定的目的片段,从而使基于SYBR Green的PCR芯片能够准确的检测基因表达水平。Superarray通过实验对设计合成的引物进行了验证,保证引物扩增的产物是单一的,基因特异性的,没有引物二聚体,也没有非特异性扩增产物。
下面是一个检测PCR芯片特异性的实验。检测PCR芯片中TGFβ和骨形成蛋白(BMP)家族各基因的熔解曲线,并且对PCR产物进行凝胶电泳实验,该家族的基因同源性很高。图4显示了BMP基因家族各基因扩增产物的熔解曲线和电泳结果。如图所示,各熔解曲线均为单峰,电泳条带亦单一,并且条带大小与预期值一致。结果表明, PCR 芯片扩增出基因产物特异性高,即使相同RNA样品中同一基因家族的同源基因也可以区别。优化的体系在SYBR Green检测中表现出高特异性,而这种特异性通常被认为只能在使用更加昂贵的基于探针的方法才能获得。
图4 PCR芯片的高特异性 RT2ProfilerTM PCR芯片对所检测的基因显示出高特异性
RNA样品为XpressRefTM人总RNA(GA-004,5ug),PCR芯片为人TGFb/BMP信号通路PCR 芯片(APH-035A),采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 荧光素PCR反应体系(PA-011)。通过标准熔解反应步骤获得熔解曲线(A),产物进一步通过琼脂糖凝胶电泳检测(B)。
重复性
实时定量PCR的定量特性使得PCR芯片的重复性强。为检测重复性,2位研究者采用了同样的总RNA样品,分别进行了4次重复试验。两个人使用同种PCR芯片,但批号不同,并且每个人都分两天进行试验。比较两位研究者分别做的4张芯片的原始Ct值。图5显示了比较结果的图示和相关系数。每一组比较结果均获得理想的曲线,斜率为1.0,相关系数均不小于0.99。结果显示,PCR芯片实验体系的重复性高,不同批次的芯片,不同时间进行实验,不同的重复设计,在原始值水平都能获得很高的重复性。
图5 PCR芯片的重复性 PCR芯片具有高重复性
RNA样品为XpressRefTM人总RNA(GA-004,5.0ug),PCR芯片为人药物代谢PCR 芯片(APH-022A),采用RT2 Real-TimeTM SYBR Green / 荧光素PCR反应体系(PA-011)。两位不同的研究者分别进行了4次重复。A图比较了原始的Ct值。B的表格则说明A中每组比较获得的曲线的相关系数。
由于PCR芯片在技术上具备很高的重复性,在确保RNA样品制备良好,PCR芯片实验操作正确的情况下,所观察到的基因表达水平的差异都是所研究的样本本身的生物学特征所引起的,而不是由于实验技术所造成的差异。表3总结了RT2ProfilerTM PCR芯片的特点。
灵敏度高 |
在仅用5ng总RNA时,可获得85%的阳性信号 |
线性范围广 |
至少10的5次方 |
特异性强 |
引物扩增出单一的,靶基因特异的产物 |
重复性佳 |
同一实验室重复实验,比较原始Ct值的相关系数(R)≥0.99 不同实验室重复实验,比较基因表达倍数的相关系数(R)≥0.97 Ct的平均标准差为0.25 |
表3 RT2ProfilerTM PCR芯片的特点