RT2 PCR引物和RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR反应体系
采用PCR芯片开展研究,技术上的难点是如何在同一次实验中,相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率,并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度,特异性和可重复性。为此,SuperArray首先设计筛选出最佳的候选引物,接着通过实验,在不同反应条件下,检测PCR反应体系与几千条PCR引物的组合,最终获得了优化的引物和PCR反应体系,适应PCR芯片的要求。
RT2ProfilerTM PCR芯片引物的特点
通过计算机分析和实验验证,引物达到以下要求:
1、特异性:通过BLAST等比对方法,检测确认引物在相应物种(人,小鼠或大鼠)全基因组中的高度特异性,有效避免非特异性产物产生。并通过实验证明引物不会扩增E.coli基因组,后者是Taq DNA多聚酶的常见污染源。
2、均一性:所使用的引物的CG含量,解链温度(Tm),以及其他一些化学的和物理的特性都相似,以保证在相同的PCR条件(尤其是相同退火温度)下,芯片中的不同的基因都能扩增出特异性产物。
3、扩增效率:引物扩增的片段大小均在100到200bp左右,确保在相同的反应时间内,不同的基因均能扩增出完整片段;并增强引物3’ 端的铆定能力,减少引物二聚体和非特异性退火的发生。
RT2ProfilerTM PCR芯片PCR反应体系的特点
在基于SYBR Green的实时定量PCR反应中,PCR反应体系也起到重要作用。严格控制的热启动Taq酶是一个关键因素。RT2 Real-TimeTM PCR反应体系采用了一种独特的,经过化学修饰的热启动Taq酶,只有在热激步骤之后,酶的活性才能完全发挥。在严格控制反应条件的情况下,在较低温度下发生的非特异性引物结合无法进一步扩增。其他的反应体系则常常将这些模板进一步扩增成为非特异性产物,造成假阳性结果。此外,Superarray还对RT2 Real-TimeTM PCR反应体系中的化学组分进行优化,进一步减少了引物二聚体的形成,并能保证最难扩增的片段都得到极高的扩增效率。PCR芯片结合了高质量的PCR引物设计和RT2 Real-TimeTM PCR反应体系,为PCR的高芯片质量提供了保证。
表格2总结了RT2ProfilerTM PCR芯片的特点。
芯片设计 |
84个通路特异性基因 |
5个看家基因 |
1个基因组DNA参照 |
3个反转录参照(RTC) |
3个阳性PCR参照(PPC) |
引物设计 |
特异性:序列比对筛选 |
一致性:统一的熔解和退火温度 |
反应效率:短的扩增片段 |
反应体系 |
热启动Taq酶: 避免引物二聚体等的产生 异性引物结合无法进一步扩增 |
反应体系为SYBR green实时定量PCR优化 |
表2 RT2ProfilerTM PCR芯片的特点
RT2ProfilerTM PCR芯片特点灵敏度
研究者总是希望能检测到表达量相当低的基因,有时候,研究者得到的起始总RNA量也很少,但仍希望能进行实时定量PCR检测。为了满足研究者的这些需要,Superarray严格检测了PCR芯片系统的灵敏度。例如,Superarray使用PCR芯片检测了一系列总RNA样本,这些样本的浓度都不相同,使用的PCR芯片为炎症细胞因子和受体基因芯片,通常,这些基因的表达量都是很低的。图3将阳性信号的比例(Ct<35的基因所占百分比)与相应的总RNA量对应起来作图。结果表明,当起始的总RNA范围在5.0ng到1.0ug(甚至是5.0ug)时,每张PCR芯片的阳性信号比率均超过85%。对于表达量更高的基因,芯片检测的灵敏度还会大大提高,即在起始RNA量更低的情况下,芯片能够检测到的阳性信号比例更高。值得注意的是,起始的总RNA量最好不要低于0.5-1.0ug,否则会造成阳性信号损失。由于阳性信号比例在起始RNA量低时会显著下降,所以在实验中,检测的最低RNA量不少于5.0ng。
图3当总RNA量低至5.0ng时,使用RT2ProfilerTM PCR芯片实验体系仍能获得很高的阳性信号比例