关键词: 反向PCR inverse-PCR 实验步骤
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⑥ 将上清移到另一管中,加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,0.1倍体积的3M 乙酸钠(pH=5.2),轻轻振荡混匀,室温静置5min;
⑦ 4℃最大速度(13, 000 rpm)离心10~15min;
⑧ 弃上清,尽量除去管壁上的液体;
⑨ 加入1ml -20℃预冷的70%乙醇,轻轻颠倒几次。最大速度(13, 000 rpm)离心5min;
⑩ 除去乙醇,在超净台上平放,将管壁上的乙醇挥发掉,20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存。
4、连接。体系如下:
12-14℃ overnight
连接体系比较大,而DNA含量比较低,不需加入PEG4000,这样可以促进分子内的连接,减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等(2002)的方法(12-14℃连接48h)。连接完成后,65℃ 水浴10min灭活。按上述3.抽提回收,溶解于40μl ddH2O中。
然后就可以用回收的链接片段做PCR了。
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电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?
电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?不会没成功吧?
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双非博士真就如大家所说没有出路?
双非博士一枚,在老师的指导下,自己也算勤奋,发了三四篇SCI,其中有一篇顶刊,手头上还有一些工作没有处理完,本来心里有些自卑,面对现在外界所说双非博士的各种言论,导致自己有些不知所措。以后进高校,哪怕你有好文章也是会四处碰壁嘛?想问问过来人的经验。
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PCR有产物但是电泳无结果
PCR后用紫外分光测定DNA含量都在450-500ug/ul,但电泳无目的片段的条带,内参也没条带。电泳中maker能跑出条带,用引物也点了样,引物的条带稍模糊但还是有,请问是哪里出了问题?
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PCR技术原理、实验步骤和应用
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