关键词: 构建敲除细胞株 CRISPR/Cas9技术
来源: 吉锐生物
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从2013年1月份开始到现在,近2年的时间里,CRISPR/Cas9技术的应用领域被来自全球优秀的科学家们不断的扩大。其中包括基因敲除,定点突变,定点整合,基因沉默,基因定位和CHIP等多个领域,而且这个技术的应用领域还在不断的被扩大。 笔者基于多年的基因重组经验(系统的研究过ZFN / IOS / TALEN / CRISPR重组技术),以及采用CRISPR/Cas9技术构建超过50多个株系的经验,重点谈一谈构建敲除细胞株系时,如何利用好CRISPR/Cas9技术。 相比于其它重组技术,使用CRISPR/Cas9技术做基因敲除是效率最高,成本最低的技术。其中的关键因素无异于下面几点:1) 明确需要敲除的基因序列 首先需要明确内含子和外显子序列;可以登录NCBI或者UCSC的网站可以方便的查到;2) 合适的靶位点选择 一般建议设计2-3条,然后转染到细胞中,用Cruiser™ 和测序的方法验证哪个靶位点的活性最好;也可以登录经过体内活性验证的CRISPR/Cas9敲除载体库,根据自己所要研究的基因选择相关载体。如若没有,可以定制(可见本文章来源);3) 敲除载体选择 根据需要可以选择空载体,带抗性的载体(Puro/Neo),带荧光标记的载体(EGFP/RFP),双敲除载体等。其中空载体较小(8K),可以提高转染的效率;抗性便于后面进行抗性筛选,荧光标记的载体便于进行流式分选;4) 单细胞生长 不同的细胞单个细胞的生长情况不一样。有的细胞长的快,有的细胞长的慢,有的单个细胞几乎就不长。这个就需要采取不同的方案了,这里推荐一个单细胞培养的小耗材:Cell Plaza™。设计精巧,采用的是共培养的原理,如果碰到不好长的单个细胞,可以试一试。同时,这个对于植物细胞做敲除时的小愈伤的生长很有帮助。从事植物基因敲除方向的研究人员,也可以试一试;5) 阳性克隆筛选 关于这个部分可以参考之前发的一个专稿:《阳性克隆筛选方法汇总》 除了敲除外,CRISPR/Cas9还可以应用在定点突变,定点整合,基因沉默,基因定位等各个方向,每个方向都有不同的细节需要把握。这里就不一一阐述,如果需要了解更多其它信息,可以随时和我们联系。
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