关键词: Gateway技术 克隆 表达 新方法
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2、PCR重组克隆
重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上,然后共同孵育PCR扩增产物和pDONR载体(包含attP位点)以及Gateway BP Clonase酶混合物。接着转化进大肠杆菌中,您将会获得包含目的基因的入门克隆,同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何Gateway目的载体进行重组(参看图2)。
3、Gateway改造过的cDNA文库
如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库,您就可以通过pDONR载体和BP Clonase酶混合物进行一个简单的重组反应,很容易地把单个克隆转换成Gateway入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序,为您节约数小时的时间。
SuperScript cDNA文库使用pCMVSPORT构建,有几种人组织来源可供选择,这些文库有很大一部分是全长的插入片段,可以完全代表来源mRNA。
4、入门克隆的切入点——克隆资源
您可以从与10000个人类基因相关的35000个克隆中进行选择,这些克隆的70%以上是全长序列的。这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术、oligo dT引物以及SuperScript II 反转录酶所构建的文库。许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会,NCI CGAP 项目,ResGen库或UltimateORF库。
克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体,所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。
图4 进入Gateway系统的各种路线
* 目前的克隆资源带有attB位点,需要与pDONR质粒重组
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小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
妇产专硕18年刚毕业,四证合一。找了个市级三甲医院,合同的。工作一个月,当时发工资,968元。之前应聘的时候说前三月试用期1300 元。试用期过后加奖金,没想到,呵呵,租房一月1000元。今天直接崩溃。打算明天打电话问财务扣的都是什么钱,了解清楚后闪人。回家继承祖业—烤地瓜,烤玉米走起。你们工作后第一个月都得多少工资呢?
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抗体保存
用奶粉或者BSA配好的一抗/二抗可以在—20度保存多久?大约几个星期还是一两个月?
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DNA提取有杂带
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