关键词: Gateway技术 克隆 表达 新方法
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目前有两种定向TOPO克隆载体。pENTR/D-TOPO 和pENTR/SD/ D-TOPO(表2和图3)有以下特点:
位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway目的载体进行有效重组
通用M13位点便于测序
基于pUC的ori位点提供高产量质粒
大肠杆菌中卡那霉素(kanamycin)抗性基因筛选
表2 两种pENTR/D-TOPO载体的简单比较
图3 Gateway定向TOPO克隆
四、构建入门载体的各种选择
1、限制性内切酶消化
作为PCR克隆的替代方法,有5种Gateway入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体,可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白,所有的5个Gateway入门载体提供了Kozak 序列。此外,pENTR11提供了SD (Shine-Dalgarno)序列,便于在大肠杆菌中有效的翻译。
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小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
妇产专硕18年刚毕业,四证合一。找了个市级三甲医院,合同的。工作一个月,当时发工资,968元。之前应聘的时候说前三月试用期1300 元。试用期过后加奖金,没想到,呵呵,租房一月1000元。今天直接崩溃。打算明天打电话问财务扣的都是什么钱,了解清楚后闪人。回家继承祖业—烤地瓜,烤玉米走起。你们工作后第一个月都得多少工资呢?
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抗体保存
用奶粉或者BSA配好的一抗/二抗可以在—20度保存多久?大约几个星期还是一两个月?
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DNA提取有杂带
PCR产物用试剂盒回收的时候,发现有杂带?有哪些办法可以提取得更干净?
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Gateway entry clone构建试剂盒 克隆与表达
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