关键词: Gateway技术 克隆 表达 新方法
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表1 反应和术语总结
图2 Gateway技术总结
在BP反应中基因转移形成入门克隆,在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
完成构建Gateway表达克隆仅需两步(图2):
(1)创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。
(2)混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶,构建表达克隆。(表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。)
有几种方法可以构建Gateway入门克隆。无论您选择何种方法,创建的入门克隆都是准备用来与各种目的载体进行重组。
(1)PCR克隆(定向TOPO克隆至入门载体或与供载体B×P重组)
(2)限制性内切酶消化和连接进入入门载体
(3)使用pCMV•SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway兼容cDNA文库
(4)Gateway改造过的克隆资源*
* 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Gateway酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。
三、PCR定向(PCR-Directional)TOPO克隆
定向TOPO克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接,产生>90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆,而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。
定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略,可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率>90%,从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或者限制性内切酶。
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