关键词: pei 转染
来源: 互联网
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PEI 转染法
材料
质粒
DNA指数生长的真核细胞
PEI (聚乙烯亚胺)1×HBS (pH7.4)
配方: PEI 储存液(100 μM):称取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS (pH7.4) 中, 0.2 μm 滤膜过滤,储存于4℃备用。
1×HBS (pH7.4): 将8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超纯水,加入20 ml 1 M 的 HEPES,调pH 值到7.4,定容至1 L,过滤(0.2 μm 滤膜)后储存于4℃备用。
方法: 1.细胞分盘: 通过胰酶消化收集细胞,用适当的完全培养基以4×105 至8×105 细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上(根据实验需要选择培养皿, 使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90%)。根据细胞贴壁情况于 含5% CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染 前换入2 mL 预热的无血清培养基。
2. 制备PEI-DNA 混合物:以60 mm 组织培养皿用420 μL 反应总体积为例。准 备两支1.5 mL 离心管,一管将质粒DNA(总量2-8 μg 为佳)加入240 μL HBS 中,混匀。
另一管中则用HBS 将100 μM 的PEI 储存液稀释成10 μM,充分 混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中,充分混匀后 室温静置20-30 min。最后将这420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述单层 细胞的细胞培养基中,轻轻摇动平皿混匀,置于含5%~7% CO2 的37℃ 温箱 孵育。
注:每次用100 μM 的PEI 储存液前都需要先将其充分混匀,保证所取的 浓度一致。
3. 培养6-10 h 后更换为37℃预热的含有血清的培养基,继续培养,16 h 左右 可以观测到报告基因的表达。
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小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
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