实验方法原理 | 临时装片法是将实验材料(徒手切片、表皮或一些低等植物等小型实验材料)放置于载玻片上的水滴中,然后加盖盖玻片制作成的玻片标本。其优点是可以保留材料的生活状态和天然色泽,一般多作为临时观察或用某些化学试剂做组织化学反应。也可选择适宜染料染色,制作成永久制片。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 先用滴管在洁净载玻片中央滴一滴清水,然后把准备好的材料放在载玻片上的水滴中,用摄子或解剖针将材料展开,使各部分都在同一平面上; 用摄子夹起盖玻片,使盖玻片的一边接触水滴边缘,然后轻轻放下盖玻片,避免产生气泡。盖玻片下的水过多,会溢出到显微镜上,可以用吸水纸从盖玻片的一侧吸去多余水分; 如果水不能在盖玻片下铺满,则容易产牛气泡,可从盖玻片的一侧再加一点清水,将气泡驱走。如果所做的临时装片需要染色,可在盖玻片一侧加一滴染色剂,在盖玻片另一端用吸水纸吸水,使染色剂迅速扩散,对材料进行染色。当然,也可以在加盖盖玻片之前加染色剂。 |
注意事项 | 如果所制作的临时装片需要保存较长的一段时间,则可用 30%的甘油水溶液代替水来封片。将制作好的装片平放在一个大培养皿中(培养皿底部先垫上一张滤纸),盖上培养皿的上盖;待盖玻片下水分散失一部分后,从盖玻片边缘补充一些甘油溶液,如此反复直至盖玻片下水分完全挥发,材料完全浸入甘油中。这样处理后的装片称为半永久装 片,可保存一个月以上。 |
其他 |
实验方法原理 | 徒手切片法是指手拿刀片,将新鲜材料或预先固定好的材料切成薄片,不经染色或经简单染色,制成水装片后进行临时观察,必要时经镜检后可选择好的薄片经过脱水与染色等制片步骤,制成永久玻片标本供长期使用。此方法的优点是不需要复杂的设备,方法简使,制片迅速,而且能观察到植物组织的天然色泽和活体结构,常用于研究植物解剖结构细胞组织化学成分等,同时也是进行石蜡制片之前科学选材的一种常用简易制片方法。它有利千临时观察、较快地得到结果;其缺点是对于材料体积过小、太软、太硬材料则难于切片,而且不能制作连续切片。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1 材料准备和修整 一般应在适当时期选取发育正常有代表性、软硬适度的新鲜根、茎、叶材料,用刀片将其切成 2-3cm 长的小段,井将其切面削平;若为质地较软而薄的材料如叶片,可沿主脉两侧切成宽 5-6mm 、长 1-1.5cm 的小块,夹在支持物(如萝卜、胡萝卜根、马铃薯块茎等)中进行切片。使用支持物时要先将支持物切成 3-5cm 长、0.5cm 宽的立方形小块,将其中部纵切一缝,然后将修整好的材料夹入其中与支持物一起切片。对于较坚硬的材料,需要经过软化处理才能进行切片。 2 徒手切片方法和步骤 (2) 切片时,右手拿刀片的右下方,左手的拇指、食指与中指夹住材料,拇指的位置稍低于食指,并使材料高出于食指 2-3mm; 切片前滴少许清水于刀面上,用以润湿材料减少切片阻力;切片时,将刀片平放在左手食指上,刀口与材料垂直,双手悬空,运用臂力,自左前方向右后方滑行连续进行切片,动作要敏捷,材料应一次切下,不要拉锯式切片,动作要敏捷,材料应一次切下,不要拉锯式切割,切下数片后,用湿毛笔轻轻将薄片移入培养皿备用。 (3)用毛笔从培养皿中挑选薄而透明、平整的切片 1-2 片放在载玻片中央,制成临时装片观察。 3 染色与保存 (1) 临时观察和短期保存:为了使材料看得更加清楚可将其染色。常用染料有 0.1%亚甲蓝、 05%-1%中性红或 1%番红水溶液等。染色方法是将选好的切片放在载玻片上,用吸水纸吸去多余水分,再滴一滴染料于切片上,加盖玻片进行观察,如需短期保存,可在染色后在切片上滴一滴 10%的甘油,再盖上盖玻片。加甘油的目的是增强切片透明度和避免切片失水变干、变黑。 (2) 徒手切片制成永久制片:染色方案很多,以番红快绿双重滴染的染色方法为例,其过程包括: ①染色:将选好的切片置于载玻片中央,加一滴 1% 番红水溶液,染色 2-3min, 倒掉染液,再滴蒸馏水洗去浮色。 ②脱水:依次滴少许 30%-50%-70%-80%-95%等各级酒精各0.5min 进行脱水,每滴一滴酒精后将废液倒人废液培养皿中,注意防止材料掉人废液中。 ③复染:倾去 95%酒精后,加一滴 1%快绿(固绿)酒精溶液,复染 20-30,, 再滴以95%酒精或用无水酒精去浮色。 ④脱水和透明:倾去 95%酒精,再加一滴无水酒精(两次),然后经 1/2 无水酒精 +1/2二甲苯,再经二甲苯(两次)每次 2-3s,使材料完全透明。若材料出现乳状混浊,则说明脱水不干净,需再用纯酒精脱水,按原步骤透明,透明后保持二甲苯不挥发(若已挥发应再滴一小滴二甲苯),盖好盖玻片后观察。若需永久保存,可在加盖盖玻片前滴一滴加拿大树胶于材料上,再加盖玻片封藏,然后置玻片标本于 30-35℃恒温箱中烘干。 |
注意事项 | |
其他 |
实验方法原理 | 石蜡切片技术是显微技术上最重要最常用的一种方法。其优点在于①应用范围广,几乎适用于所有的植物材料;②能将材料切成厚薄均一的切片,较清楚地显现细胞、组织的细微结构;③能切成连续蜡带,可观察细胞和组织的动态发生及层次变化过程;④切片可以长期保存,便于以后观察比较。缺点是:操作程序比较复杂,需要时间较长,有些质地过硬的材料也不宜采用;另外,石蜡制片需要一定条件和设备。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 石蜡切片法的整个过程较复杂,可大体概括为:取材-固定-脱水-透明-浸蜡-包埋-修块-切片-精片-脱蜡分染色-脱水-透明-封藏 石蜡制片程序如下: 1 材料采集、分割:采集材料应根据制片的目的和要求而定,材料要有代表性和完整性,无病虫害及其他损伤。根据所采集材料的特征,依据不同的分割方法分割为适当的大小,分割大小一般不超过 0.5-1.5cm3。如果是子房、花药,就不需进行分割。 2 杀死与固定:采用一定的化学溶液(固定液)在尽可能保持细胞生活结构的情况下迅速杀死组织的过程。其作用有:①防止组织溶解及腐败;②使细胞内各种成分沉淀保存下来,保持其原有的生活结构;③便细胞内的成分产生不同的折射率,形成光学上的差异,便于观察;④使细胞硬化不容易变形,利于固定以后的处理。 固定时应根据材料的性质及制片目的选用合适的固定液,常用的固定剂有 F.A.A 、卡诺氏等固定液。要根据材料大小、多少掌握固定液的用量;某些含水量大的材料应多换儿次固定液,以保证固定液维持一定的浓废;若材料漂浮在固定液表面,则用注射针管或抽气机进行抽气处理或用其他机械处理办法抽去细胞间隙的空气,直至材料全部浸人固定液;另外,严格掌握固定的时间,要视材料的种类、性质、大小和固定液的种类而定;固定完毕的材料,若不能立即制片,可放于 70%酒精中存放。如用 F.A.A 固定液,固定 24h 后,材料仍可保存在固定液中备用。 ` 3 脱水•脱水的目的是除去组织内多余的水分,使材料变硬,形状愈加稳定;利于材料的保存和下一步的透明、浸蜡等。常用的脱水剂为酒精,其原则是从低浓度逐级移入高浓度,否则会引起材料的强烈收缩而变形,即由 30%-50%-70%-85%-95%到无水酒精(两次),具体从哪一级酒精开始脱水,应依据固定液的性质而定。材料在各级酒精中处理的时间视材料大小和性质而定,通常每级停留 2-4h, 无水酒精每次停留 1.5-3h, 已切好的切片每级停留 3-20min 。 4 透明:透明的目的是除去脱水剂,使材料透明并增加折光系数;同时便于包埋剂(石蜡)进人组织中。最常用的透明剂为二甲苯,使用原则是也要逐渐进行,可减少材料收缩,即由 1/2 纯酒精十 1/2 二甲苯到二甲苯(两次),每级为 1-2h。二甲苯透明能力强但易于使组织收缩变脆,使用时不能在其中停留时间过长,同时脱水要干净。在 1/2纯酒精十 1/2 二甲苯混合液中时,可加入少许番红干粉,使材料若色,便于包埋在石蜡中后容易看见材料的位置,切片时易于辨别材料的方向。若材料放入 1/2 纯酒精+1/2二甲苯混合液中时溶液变混浊,说明材料中含有水分,材料脱水不彻底,应把材料逐步退回至无水酒精中再进行脱水。 5 浸蜡:浸蜡的目的是逐渐除去透明剂,并为包埋剂(石蜡)所代替,以便进行包埋。石蜡又是包埋剂,其熔点在 42-60℃之间。软的材料用 54-56℃熔点的石蜡,如果材料较硬,应选用熔点较高的石蜡;切片较薄时(在8μm以下)选用熔点较高的石蜡;气温较高时用熔点较高的石蜡,气温较低时用熔点较低的石蜡。石蜡必须纯净,不含杂质。浸蜡过程是使石蜡慢慢进人浸有透明剂的材料中,然后用石蜡完全代替透明剂进入材料组织中。浸蜡的力法如下:材料经二甲苯透明后,倒去一部分二甲苯,然后轻轻倒上已熔化的石蜡。倒入的石蜡即凝成固体,然后将装有材料的小瓶放在 35-37℃温箱中过夜,经 1-2 天直至石蜡不再继续熔化为止。调节温箱温度到 56-58℃左右,待石蜡完全熔化后倒去,换三次新鲜纯蜡,每次停留 2-5h, 使留在组织内的二甲苯全部被石蜡替代。 6 包埋:就是将已浸好蜡的材料连同熔化的石蜡一起倒入定形的纸盒中,并根据需要把材料按一定间距调整好位置,使之凝固,这样就把材料包埋在石蜡中,去掉纸盒后蜡块可长期保存各用。 7 整修与固着(图 1-2-3), 将已包埋好的蜡块,按需要切面(横切或纵切),把大蜡块裁成小蜡块,用单面刀片去掉材料四周多余的石蜡成为大小适当的方块,并修出切面,修好的蜡块各边要平行,否则切出的蜡带不会平直,然后用烧红的蜡铲把蜡块底部牢固的粘换在木质蜡座上,以避免切片时脱落。 8 切片(图 1-2-3), 用旋转切片机将蜡块切成连续蜡带,其厚度一般在 8-14μm之间。切片时,将材料夹在切片机的固定位置上,调整材料切面与切片刀口平行,根据观察的要求调节好所需要的切片厚度。切片过程中往往会出现各种问题,需要分析原因,及时纠正。 9 粘片与展片:在干净载玻片的中央滴一小滴蛋清甘油(或明胶甘油)粘片剂,以洗净的手指涂抹均匀,范围以足够粘贴蜡片为度,多余粘贴剂应抹去,在载玻片左侧用记号笔写上编号,并加数滴蒸馏水于载玻片中央,取镜检合格的蜡片,以光亮的一面向下平放于载玻片的水面上,随后将已放材料的玻片,平放在 35-40℃的展片台上,使蜡片展平(或在酒精灯上稍许加热)并摆好蜡片位置,去掉多余水分,放入摊片盘中,装滴一盘后移至恒温箱中 (38-40℃)继续烘干(常需 2-3d)备用。 10. 染色制片:切片贴好烘干后可进行染色制片。染色方法很多,根据制片目的而定。下面以植物制片中最常用的番红与固绿对染的方法为例,说明从脱蜡、染色至最后封藏的全部制片过程。 (1)脱蜡:先将二甲苯盛入染色缸中(容量为缸的 4/5), 将已烘干待脱蜡的玻片放入缸中 5-10min, 使石蜡完全溶解后,转入 1/2 二甲苯+1/2 纯酒精中 3-5min。 (2)复水:脱去蜡的切片经各级酒精到蒸馏水。即由无水酒精到95%-85%-70%-50%-30%各级酒精到蒸馏水,每级 1-2min 。 (3)番红染色: 0.5-1%番红水溶液中染色 2-24h 。 (4) 冲洗:用自来水轻轻洗去多余的染色液。 (5)脱水:依次用 30% 、 50% 、 70% 、 85% 的酒精处理,每级 1-2min 。 (6) 固绿染色用 0.1%的固绿的 95%酒精溶液复染 10-40, 。 (7) 透明、封藏:经 95%酒精到无水酒精(两次)到1/2无水酒精 +1/2 二甲苯到二甲苯(两次),每级 2-3min, 加拿大树胶封片。 |
注意事项 | |
其他 |
实验方法原理 | 将小而扁平的检物材料全部封藏起来,所以用此法制作的玻片标本可显示出植物或植物某部分器官的整体。这种方法适用于微小或扁平的材料,例如丝状或叶状的藻类、菌类蕨类的原叶体抱子襄、纤小的苔鲜植物,以及被于植物的表皮、花粉粒、幼胚等幼小的器官。可以制成临时装片,也可以制成水久制片。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 由于材料不同、研究的目的不同,以及所用的脱水剂、透明剂、封藏剂不同,整体封藏法有多种方法。 1. 甘油法 甘油法是最常使用的一种制片方法。甘油法是用甘油脱水和透明,并封藏于甘油中,方法简单并可保持植物的自然颜色。对于制作含有色素的材料(如绿藻)效果较好,必要时还可以进行染色,故可有染色和不染色两种制片法。以水绵为例,依据下列步骤可制成染色的和不染色的封片。 (1)不染色制片法 小采集新鲜水绵,用水洗净附着的泥土后,取少许丝状体放在小培养皿中,加多量的10%甘油。将滤纸盖于液面上,以防尘土落于其上。然后把培养皿放于较温暖的地方,使水分慢慢蒸发至纯甘油浓度,在此过程中,材料逐渐同时被脱水和透明了。 ①用镊子取出少许水绵,放在载玻片中央展开,在显微镜下检查,如果材料没有收缩或变坏,使可进行装片,即在材料上滴一小滴纯甘油,将丝状体挑开,盖上盖玻片。甘油不可太多,如果甘油多到从盖玻片边缘溢出,就会影响下一步封藏,此时可将盖玻片拿开,用滴管将多余的甘油吸掉,重新加盖玻片。 ②用较稠的加拿大树胶(也可以用火漆及其他易干漆封边)沿盖玻片四周封边。 (2)染色制片法 ①洗净的水绵,放在标本管中,加入铬酸-乙酸固定液固定 24h, 固定液量约为材料体积的 20 倍。 ②流水冲洗 24h 后,将材料放在培养皿中,换水洗 5-6 次。 ③用蒸馏水洗 1-2 次。 ④把材料移入标本管中加 1%曙红或洋红水溶液中染色约 12h。用苏木精染色(可用4%铁矾作媒染剂)效果也很好。 ⑤用蒸馏水把多余染料洗去。在显微镜下观察,如果染色不够深,应重染;过深则可放在 1%-2%的乙酸中分色至合适的程度。 ⑥把材料放在培养皿中,加 10%甘油,盖上滤纸,放于通风处蒸发至纯甘油浓度。然后装片、封边即可。 甘油法操作时的注意事项: (1)蒸发速度不可太快,否则材料易收缩,因此不宜放在过高的温度下。蒸发期间不宜添加 10%甘油,以防材料由于浓度骤变而收缩; (2)10% 的甘油用量不能少于材料体积的 10 倍,这样在蒸发至纯甘油浓度时仍能浸润材料,小至于干涸; (3) 封片时,不宜放置材料太多,要互相分开,避免因重叠而影响观察效果。 2 甘油胶法 这种方法与甘油法相似,所不同的是用甘油胶封藏。一些不易收缩的材料,如花粉粒制片常用此法。其优点在于操作方便,而且有利于观察花粉粒的形态。当把制作好的封片在酒精灯上微热,使甘油胶熔化,然后用手轻轻移动盖玻片,此时花粉粒在甘油胶中转动,即可观察到花粉粒的整体形态和特征。 用甘油胶法制作装片时,先把配好的甘油胶(加一些甲基绿)放在温箱中或用热水浴使之熔化,在载玻片上滴一小滴甘油胶,放人新鲜花粉粒或已用甘油脱水透明的材料,然后封藏。 3 二甲苯树胶封藏法 如做表皮整体封藏,可撕取表皮后固定于 FAA 或 70%酒精中,经 50%-30%酒精(每级 1-2min)后放入 1%番红水溶染色液中1h, 再进行酒精系列脱水,经 30%-50%-70%-85%酒精脱水(每级1-2min)后,放人固绿染色液中几秒钟,冉经 95%-100%-100%酒精-1/2纯酒精 +1/2二甲苯(每级1-2min) 后,放人二甲苯中透明,最后用加拿大树胶封藏。 |
注意事项 | |
其他 |
实验方法原理 | 用一些化学药品配成离析液,便组织细胞的胞间层溶解,细胞彼此分离,获得分散的、单个的完整细胞,以便观察不同组织的细胞形态和特征。经离析制备的材料可制作临时装片观察,也可制成永久玻片标本长期便用。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1 铬酸-硝酸离析法 适用于木质化的组织,如导管、管胞、纤维等。离析液由 10%铬酸和 10%硝酸等量混合而成。具体步骤是将植物材料(如木材、枝条、果壳等)先切成火柴棒粗细、长约 1cm 的小条或小块,放人小玻璃管中,加人离析液,其量约为材料的 20 倍,将口盖严塞紧,放在30-40℃的温箱中,经 1-2d。具体浸渍的时间可因材料块的大小而不同,如果两天以后仍未分离,则可换新的离析液继续浸渍。草本植物可不必加温。 检查材料是否离析:以细胞间的胞间层溶解、细胞彼此能够分开为宜。可取出材料少许放在载玻片上的水滴中,加盖破片,用滴管的橡皮头轻轻敲压,若材料分离,表示浸渍时间已够。这时倒去离析液,用清水浸洗已离析好的材料。将玻璃管静置,待材料下沉后,再倒去上清液,如此反复多次,至没有任何颜色为止(如有离心机,可将材料转人离心管,用离心机洗酸更为迅速),然后转移到 70%酒箱中保存备用。需要时,可按临时装片法制片观察或制作成永久性的玻片标本。 2. 盐酸-草酸按离析法 这种方法较前面的方法缓和,适用于草本植物的髓、薄壁组织和叶肉组织等柔软材料。具体方法是:把材料切成小块,约 1cmx0.5cmx0.2cm 大小,放入 3:1 的 70%或 90%酒精和浓盐酸中。若材料有空气,应抽气,抽气后更换一次离析液。 24min后,用水清洗干净。放入 0.5%草酸按水溶液中,时间的长短视材料的性质而定。可以每隔 1-2d 作检查。其余方法同上。 3 硝酸离析法 适用于木材坚硬的材料,离析液为 30%-40%的硝酸液。离析时可将材料依上法切成小段,放人离析液中,然后将盛有材料的烧杯在酒精灯上加热,煮半小时以上,当发现材料松软时,即可倒去离析液,用水洗 5-6 次,然后贮载在 70%酒精中备用。 4 氢氧化钠透明离析法 此法是目前最简单的透明、离析柔软或较坚硬植物材料的方法。材料经固定以后,投入 5%氢氧化钠水溶液中,在温度为 50℃左右恒温下处理 24-48h。如果离析液发生混浊时,须更换 1-2 次离析液。离析较坚硬的材料时,氢氧化钠的浓度应提高至 6%-10% 。 |
注意事项 | |
其他 |
实验方法原理 | 将植物的幼嫩器官如根尖、茎尖和幼叶等经过处理后,被涂抹或压在载玻片上,使组织成一薄层然后进行观察的制片方法。染色后可做临时的观察标本,也可以经过脱水、透明等步骤制成永久的玻片标本。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1 幼根的培养 取洋葱或大蒜的鳞茎置于广口瓶上,瓶中盛满清水,使洋葱或大蒜的下部(鳞茎盘)浸人水中,置于温度在 20-25℃的温暖处,并注意每天换水, 3-5d 后,即可长出幼根。 2 材料的固定和离析 先用等量的浓盐酸和 95%酒粘配成混合液,这种溶液既能迅速杀死细胞并保 其细胞结构接近于生活状态,又能溶解细胞间的中胶层,在压片时使细胞易于分散,故称其为固定离析液。当上述幼根长到 2-3cm 时,即可进行固定和离析处理。具体方法是在上午 10-11 点之间,将 3mm 左右的根尖剪下,立即投入上述固定离析液中,经 3-5min, 取出放入清水中漂洗几次即可制片。也可经过 50%的酒精后将其保存在 70%酒精中保存备用(在 4℃冰箱中可保存 7-10d) 。 3 压片的制作 取一个经过固定离析的根尖,放在干净的载玻片上,加一滴 0.5% 的龙胆紫染液染色2min, 用解剖针轻轻将根尖压裂,再盖上盖玻片,用右手大拇指对准盖玻片下的材料,垂直均匀用力下压,将材料压成均匀的、单层细胞的薄层,用吸水纸条吸去溢出的染液即可在显微镜下观察,这时可以看到许多离散的各个分裂时期的细胞。若染色过浅,可在盖玻片一侧冉加一滴染液染色;如果染色过深,可在盖玻片一侧加一滴 45%的乙酸进行褪色。 上述压片也可用小麦、水稻的颖果和蚕豆等种子萌发出根后制作。但要注意不同植物根尖细胞有丝分裂活动的高峰是不同的,所以取材固定的时间也不一样,如小麦在上午 11 时至下午 1 时,水稻在下午 4 时左右,玉米和蚕豆除在上午有一个高峰外,若下午进行实验,可于 3-4 时固定,也可获得分裂相较多的根尖细胞有丝分裂压片标本。如果是事先固定的材料,上课时分发给学生使用,则可于午夜 12 时取材,分裂相更多。若将材料用秋水仙素进行预处理和低温固定,所制得的压片中细胞分裂相会更好,且染色体清晰可见,可用丁观察细胞染色体的形态、数目和组型分析。 |
注意事项 | |
其他 |
实验方法原理 | 植物解剖学中,利用新鲜材料与染色或化学反应方法柜结合,一方面用来确定梢物细胞壁或内含物的化学性质,另一方面用来分辨细胞的结构。显微化学试验可先用徒手切片法将材料切成薄片,一般应稍厚,大约在 20-40µm 之间,如杲太薄,有时因为所要观察的内容物太少,反而不易清楚地显示结果。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1 显示纤维素的化学方法:植物细胞的细胞壁最主要的成分是纤维素。纤维素在碘和硫酸的作用下变成蓝色。在细胞中,纤维素的成分越多,蓝色越明显,而强烈木质化的细胞壁,对纤维素虽然仍能发生上述反应,但因它被木质掩盖,因此不能作用,而小变蓝色。 方法是用 1%碘液(配制方法:先将 1.5g 碘化钾溶于 100mL 蒸馏水中,待全溶解后,加入 1g 碘,震荡溶解)滴在材料上,然后再加一滴 66.5%硫酸 (7 份浓硫酸 +3 份蒸馏水),经过这样处理,纤维素的细胞壁呈蓝色反应。 2 显示木质素的间苯三酚反应:间苯三酚反应是植物显微化学中检验木质化最常用和最简单的方法。切片先用一滴盐酸浸透(因间苯三酚在酸性环境下才能与木质起作用),然后滴一滴间苯三酚的乙醇溶液,木质化细胞壁可现出樱桃红或紫红色,其颜色深度取决于细胞壁木质化的程度。此染色法不适于作永久切片,因颜色会慢慢退去而变成淡黄色。 3 显示栓质和角质的化学方法:栓质和角质均为饱和与不饱和脂肪酸的衍生物,与苏丹Ⅲ作用呈现橘红色反应。 4 显示果胶质的化学方法:果胶质在植物细胞中分布很广泛,细胞壁胞间层部分甚至全部由果胶质所构成。检测植物细胞中的果胶质常采用钌红染色法:切片用 0.02%的钌水溶液染色 30 min, 细胞壁中的果胶成分被染成红色。另外亦可采用番红染色法:配0.5%-1.0%番红水溶液,可将果胶质细胞壁染成橙黄色(木栓质与木质素染成樱红色),此染液的缺点是不稳定,易褪色,如将切片用凡士林或石蜡在盖玻片周围封闭,置丁 2%绷酸中则能保色几个月。 5 显示淀粉粒的碘-碘化钾反应:淀粉是植物细胞中主要的储藏物质,它们在各种不同的植物细胞中形成各种不同形状的颗粒。由于碟与淀粉作用形成碘化淀粉呈蓝色反应,因此用碘液测试淀粉已成为最常用的方法。 6 显示多糖的高碘酸-希夫反应 (PAS 反应):利用高碘酸(氧化剂)破坏多糖分子中的 C-C 键,变为醛基,碘基与希夫试剂(无色亚硫酸复红)柜结合,生成红色的反应产物。这一过程称为 PAS 反应。 试剂配制 (1)0.5%-0.8%高碘酸水溶液。 (2) 希夫试剂:将 1g 碱性品红溶于 200mL 煮沸的蒸馏水中,摇动 5-10 min, 冷却到50℃ 时过滤。向滤液中加入 1mol/L 盐酸 20mL, 冷却至 25℃, 加 2g 偏亚硫酸钾(或钠盐),摇匀,静置暗处过夜。加活性炭 2g, 摇动 2-3min, 用滤纸将溶液过滤于棕色细口瓶中。滤液应该是无色或淡黄色,若呈红色则不能使用。将合格的染液置于黑暗低温 (0-4℃) 下储存备用,用前将染液升到室温。若使偏业硫酸钾 2-3 倍于碱性品红,可增强希夫试剂活力。在提高偏亚硫酸钾用量的情况下,可使碱性品红变成无色,不用活性炭去色过滤。 (3) 洗涤液:偏亚硫酸钾(或钠)溶液 10%偏亚硫酸钾 5ml, 1mol/L HCI 5mL 蒸馏水 90mL 临用时将二者混合,使用新鲜混合液。 制片程序 (1)切片脱蜡至蒸馏水; (2) 流水冲洗 15-30 min; (3)0.5%-0.8%高碘酸溶液处理10 min; (4) 流水洗涤 5-10min, 蒸馏水过滤; (5) 移入希夫试剂中 20-30min; (6)用偏业硫酸钾溶液洗 3 次,每次 2-3 min;(7)流水洗涤 10-15 min, 并通过蒸馏水 5 min;(S)按常规通过各级乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片。 7 显示蛋白质的汞-溴酚蓝法:蛋白质是构成原生质休的主要成分,也可成为后含物储藏在细胞内,成为无定形的结晶体或糊粉粒。目前测定糊粉粒最普通的方法是氯化汞-溴酚蓝法(试剂配制: 10g 氯化汞 (HgCI2),0.001g 溴酚蓝溶于 100mL 蒸馏水中]。将切片滴上此液一滴,染色 5min 后用 0.5%醋酸冲洗,除去切片上多余的染料,再放在培养皿中水洗 5 min, 用甘油封藏观察。细胞中有糊粉粒则被染成鲜蓝色。 8 显示油、脂肪、挥发油的化学力法:植物解剖中,染脂肪性物质最常用的是苏丹 III溶液,它有两个浓度不同的配方: A 苏丹 Ill( 或苏丹Ⅳ) 0.1g 95% 乙醇 10mL 甘油 10mL B 苏丹 Ill( 或苏丹Ⅳ) 0.0lg 95% 乙醇 5mL 甘油 5mL 切片放在上述任一种溶液中染色 24h, 然后用 50%乙醇洗涤,放人甘油中观察,油脂可染成淡黄色或红色,同时为了加速染色,可以微微加热 9 显示单宁的亚硫酸铁反应:单宁是一类酚类化合物的衍生物。许多植物细胞中都含有单宁,它存在于细胞质、液泡或细胞壁中。单宁被认为具有保护植物,抗水解、抗腐烂和动物危害的作用将新鲜组织切片投入 0.5%-1.0%的亚硫酸铁或氯化铁溶液(用 0.1mol/L HCI 配制)中染色后,可作暂时性封片进行观察;也可经乙醇脱水,二甲苯透明,制成永久制片。染色结果:若出现蓝色沉淀物则表明有单宁存在。 10 显示 DNA 的孚尔根反应:利用切片经 1mol/L HCl 60℃水解处理后, DNA 的脱氧戊糖间的醛基成为自由状态。希夫试剂同暴露出来的醛基发生反应,将核的染色质染成深紫红色。 试剂配制: (1)1mol/L HCl 。 (2)希夫试剂配法见“多糖的高碘酸-希夫反应”。 (3)偏亚硫酸钠水溶液(洗涤液)配方见“多糖的高碘酸-希夫反应”。 制片程序 (1)组织经卡诺固定液固定4-8h, 固定时间不宜太长,太长会水解 DNA,减弱染色强度。 (2) 切片脱蜡并逐步过渡到蒸馏水。 (3) 在冷 1mol/L HCl 中 1-2min 。 (4)60℃热 1mol/L HCl 处理 15 min。 (5) 用冷 1mol/L HCl 略洗。 (6) 蒸馏水漂洗。 (7)希夫试剂反应 1-2h( 暗处)。 (8) 用偏亚硫酸钠水溶液洗 3 次,每次 3-5mm 。 (9) 流水冲洗 15-30min 。 (10) 蒸馏水漂洗。 (11)各级乙醇脱水,每级 10-15 min。至 95% 乙醇时,可用 0.1%亮绿(或固绿)的 95%乙醇溶液复染 15-60s 。 (12) 二甲苯透明,树胶封片。 |
注意事项 | |
其他 |
实验方法原理 | |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1 取材:用于固定的材料要求切割成 1mm3而大小的小块。太大固定液不易透入,造成材料内外固定不均;太小则材料受损伤的比率增高。取材时应注意:由于取材时要求切的组织块很小,组织受损伤的比例相当大,这无疑会引起细胞代谢的巨大变化,因此,切取后的组织应立即放人固定液中进行固定;植物体大多数部位的组织是由各种类型细胞组成的,因此在取材之前必须对材料所包含的细胞类型有比较清楚的了解。特别注意要使试验和对照的取材严格一致。 2 固定:通常采用戊二醛和锇酸双重固定法,具体步骤如下: (1) 将材料切成约 1mm3的小块,立刻投人用 0.2 mol/L 磷酸缓冲液 (pH 值 7.3) 配制的 2.5%戊二醛固定液中,于室温下固定 2h 。 (2)倒去戊二醛固定液,材料用 0. 1mol/L 磷酸缓冲液冲洗 3 次,每次放置30min 。 (3)用 2%饿酸(以 0.2mol/L 磷酸缓冲液 (pH 7.3)稀释 4%的饿酸贮液而成],在 4℃冰箱中固定 2-4h 。 (4)用磷酸缓冲液冲洗。 3 脱水:经戊二醛和锇酸双重固定并彻底清洗过的材料即可开始脱水。对常用的环氧树脂包埋剂而言,乙醇、丙酮、氧化丙烯作为脱水剂都是比较合适的。脱水要逐级进行,存 90%浓度之前,每级停留的时间可短些,到达 90%浓度之后要适当延长脱水时间。一般可按下列步骤进行: 30%丙酮 15min,50%丙酮 15min,70%丙酮15min,80%丙酮15min,90%丙酮 15 min,100%内酮 30min, 100%丙酮 30 min 4 渗透、包埋与聚合• 最常用的包埋剂是环氧树脂类,如 Epon812 、 ERL-4206 和Araldite, 它们的主要区别是黏度不同。包埋剂 Epon812 混合物可按下列配方配制: 前二种药物按顺序混合后搅拌均匀,然后边搅动边一滴滴加人 DMP-30, 每加一滴允分搅拌后冉加下一滴,-般要搅拌半小时以上 用环氧树脂作包埋剂时,整个渗透、包埋和聚合的操作步骤如下: (1)植物材料转人丙酮:包埋剂 =3:1 的混合物中渗透 2h 。 (2)材料转入丙酮:包埋剂 =2:2 的混合物中渗透 2h 。 (3)材料转入丙酮:包埋剂 =1:3 的混合物中渗透 2h 。 (4) 材料转人纯包埋剂中过夜。 (5)将材料转入包埋板中,放好标签,注满纯包埋剂,放人 37℃温箱中过夜。 (6)将包埋板放入 60℃温箱中聚合 24-48h 。 5 切片:将修整好的标本块固定在切片机的样品忏内,然后将做好刀槽的玻璃刀装在刀架上,使样品块的长边在下,使刀成 4°-8°的间隙角,调整灯允位置,使成暗场照明,在双目显微镜下选拌刀口。锋利部分光缘极细,几乎看不到亮线出现,而刀口有缺陷的部分则因光缘散射出现明显亮线。选好刀口后,将蒸馏水注入刀槽内使液面水平,刀口润湿。将组织块对准所选用的刀口,先用粗调,后用细调使样品接近刀口。同时让样品作上下切割运动,直至切下切片,这时立即启开自动钮,开始干式切片。然后用具膜的铜网将厚度为 70 nm 以下的切片黏起,置于培养皿中的滤纸上干燥。 6 染色超薄切片的染色是通过某些重金属原子和细胞超微结构结合后,增加了细胞各组分对电子的散射能力,从而提高了标本的电子反差,使标本影像在电镜下看得更为清晰。超薄切片的常规染色方法是采用醋酸铀和柠檬酸铅的双染法。 |
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