标签: 纯化病毒 超速离心 病毒学检验第一篇第五章
病毒粒子经过初步浓缩之后,要进一步纯化,通常采用超速离心法(ultracentrifugation)。来源:《病毒学检验》
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将被分离的样品交替进行低速离心与高速(或超速)离心。差速离心适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放的病毒悬液中提纯病毒。在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时,由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在,提纯效果不理想。
以差速离心法分离提纯病毒时,经常以低速 (2 000~3 000 r/min, 20~30 min) 及中速(10 000 r/min,20~30 min) 去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。然后,选择在 60 min 内能够沉淀 80% 以上的病毒粒子的较高速度,离心 1~2h使病毒沉淀。
(1) 根据病毒的密度选择适宜的溶质,用梯度制备仪制成适宜的梯度介质,病毒的密度最好包括在梯度介质的中部或近介质底部 1/3 处。
(2) 将欲纯化的病毒悬液约 1 ml 小心铺加于梯度介质,以 20 000g~40 000 g 离心 2~4 h离心速度和离心时间的选择可根据病毒的大小而定,如流感病毒需 28 000 g,而如乙脑病毒则应40 000g 。
(3) 病毒沉于介质的中部形成一明显的沉淀带,另有若干杂蛋白带。小心吸出病毒并透析后,用生物学方法或电镜检查确定是否为病毒带。
(1) 取浓缩后的病毒悬液 5 ml, 加入 1/5 或 1. 66/5 体积的 600 g/L 的蔗糖溶液,使其含蔗糖10%~15%, 摇匀。
(2) 取一内盛 4 ml 40%~60% 的蔗糖溶液的离心管,将上述病毒悬液小心铺加于此蔗糖溶液上面,于 20 000~40 000g( 根据病毒的大小和密度而定)离心 60~90 min血病毒在两个界面间形成一条明显的带。
(3) 小心用毛细吸管或注射针头吸出,此时病毒悬液中大部分密度大小不同的颗粒即被分开。密度较小的浮在上层,密度较大的沉在下层。以上过程必要时可重复一次。此法所制备的病毒悬液体积较小,纯度较高。
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