标签: 蛋白质 提取物 破碎组织 蛋白质与蛋白质组学实验指南
从组织和细胞中提取蛋白可能是蛋白质组研究中最关键的一步,因为这一步影响了蛋白的产率、生物活性和特定目的蛋白结构的完整性。因此,我们要注意蛋白提取条件的选择。主要目标是在破坏力最小、保持蛋白结构完整性的前提下,可重复地使细胞最大程度地裂解。 [澳]理查德J.辛普森(RichardJ.Simpson)主编 何大澄主译
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实验方法原理 | 对于细胞内蛋白的纯化和特性分析,重要的是选择一种有效的方法来破碎细胞或组织,使蛋白迅速地从胞内相对隔离的空间中释放到缓冲液中,而该缓冲液应对所研究的蛋白的生物活性没有影响。广泛使用的破碎软组织的方法之一是勻浆。 在本方案中,讨论了使用机械力匀浆组织:在 Potter-Elvehjemglass-Teflon 勻浆器 (见图 3.1)、Dourxce 手动勾装器或便携式韦林揽切器(Hand-heldWaringBlender) 中切碎组织的三种程序。这些方法快速、安全,且蛋白酶从其他的细胞区隔中释放出来的风险很小。可以通过在匀浆缓冲液中加人蛋白酶抑制剂来降低蛋白酶的水解作用。 |
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实验步骤 |
1.从动物中取出组织后,修剪并去除脂类和结缔组织,然后放入预冷的匀浆缓冲液 A 中。 2.用切刀把洗好的组织切成小块(如 1cm 方块),或者把这些组织放在绞肉机上搅两次。 像肝脏、大脑、肾和心脏等组织很容易在韦林搅切器中破碎,但是骨骼肌和肺则很难,所以应在勻浆之前先用家用绞肉机来绞碎。许多纤维组织,比如哺乳动物胸腺,必须在匀浆之前冰冻以利于破碎(常用 Ultra-Turrex 勻浆器)。培养的哺乳动物细胞和少量的软组织(1~5 g),比如脑,可以使用 Dunce 手动勻架器(Dignam,1990) 来勻浆。在所有情况下,都要 4°C 预冷匀浆器和玻璃容器,并且匀浆操作应该在冷室中进行。 3.将组织加入 3~4 倍体积的匀浆缓冲液 B 中,然后转移到匀浆器中。 4.使用下面的方法来制备匀浆液。 Potter-Elvehjem 勻浆器:仪器设置在 500~1500r/min,勻浆组织数次,每次 5~10s。 Dounce 手动匀浆器:匀浆组织 10~20 次。 韦林搅切器:匀浆组织 3~4 次,每次 20~30s,间隔 10~15s。 5.把匀浆液倒入玻璃烧杯,把烧杯放在冰上,在 4°C 条件下温和搅动匀浆液 30~60 min,以便充分提取蛋白。
6.4°C 条件下 10000g 离心 10~20 min,除去匀浆液中的细胞碎片和其他物质。 7.过滤漏斗中铺两层纱布(或加一层玻璃棉)来过滤上清,除去漂浮在表面的脂类物质。小心地拧纱布以便获得最大量的滤液(称为「粗提液」)。 8.尽快用适当的分离方法和分析方法处理样品。
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实验方法原理 |
培养的动物细胞一般使用温和去垢剂来裂解。如果低浓度的去垢剂就能引起细胞的充分裂解(如 l%NP-40 或 l%Triton X-100),那么这对目标蛋白的影响可能比方案 1 中所讨论的匀浆方法更温和。去垢剂的选择必须根据免疫沉淀所用的抗体的识别表位的性质来决定。假如抗体识别线性抗原表位(如合成肽),那么可以使用强变性裂解缓冲液(如 RIPA 缓冲液)。另一方面,假如抗体识别有构象的表位,则应使用 NP-40 裂解缓冲液(或 1%TritonX-100)(裂解缓冲液细节见表 3.5)。 本方案由 Hong Ji(Joint Protomics Laboratory of the Ludwig Institute for Cancer Research,and Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research,Melbourne,Australia) 提供。
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实验步骤 |
一、方法 A: 单层培养的细胞的裂解1.去掉培养基,并用冷 PBS 洗细胞 2 次。 2.把培养瓶置于冰上。 3.100mm 的培养瓶(预冷至 4°C) 中加入 10ml 裂解缓冲液,裂解缓冲液的体积应根据培养瓶的大小来调整。 4.冰上孵育细胞 10~30 min(取决于所孵育的细胞系),并不时地摇动瓶子。 5.在冰上倾斜瓶子,使缓冲液流向一 边,用吸管将裂解液转移到一’个微量离心管或其他合适的离心管中。其他培养瓶均如此操作。 有些研究者喜欢把细胞从培养瓶中刮下来,但这可能产生细胞张力,只在特殊情况下使用。 6.4°C 条件下 20000g离心裂解液 10min。 7.小心地把上清移到另一个试管中,应确保不要碰到沉淀物。将裂解液放置于冰上,以备免疫沉淀所用(见 Harlow and Lane,1999) 细胞裂解液可以使用干冰和乙醇的混合物迅速冰冻,一70°C 条件下可以长期储存。但是,通过免疫沉淀分离的蛋白复合物的分析,建议使用新制备的细胞裂解液。 二、方法 B: 悬浮生长的细胞的裂解1.细胞在 480 g的离心力条件下离心 10 min,弃去上清。 2.用冷 PBS 洗细胞两次,然后将洗过的细胞置于冰上。 3.重新悬浮沉淀,使 1.0 ml 裂解液(冷却到 4°C) 中含大约 1X107~5X107 个细胞。 4.冰上孵育细胞 15 min,并不时地振动小管。 5.4°C 条件下 20000 g 离心裂解液 10 min。 6.小心地把上清移到另一个小管中,应确保不要碰到沉淀物。将裂解液置于冰上,以备免疫沉淀所用(见 Harlow and Lane,1999)。 细胞裂解液可以使用干冰和乙醇的混合物迅速冰冻,-70°C 条件下可以长期储存。但是,通过免疫沉淀分离的蛋白复合物的分析,建议使用新制备的细胞裂解液。
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实验方法原理 | 去垢剂裂解细胞法通常用于培养的动物细胞。典型的离子型去垢剂SDS(如2%SDS)能充分地裂解细胞。培养的动物细胞和细菌,如可以使用这种方式裂解。假如实验所用的抗体识别的抗原决定簇取决于自然空间构象,并对还原环境敏感,那么在裂解缓冲液中应除去二硫苏糖醇,并建议使用非还原/无脲的凝胶(Ji,et al,1997;Ji and Simpson,1999)。 |
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实验步骤 |
1.将1X107~5X107个细胞加到1ml含有100 mmol/L DDT的Laemmli样品缓冲液中。 2.由于DNA的释放,在Laemmli缓冲液中细胞裂解液变得很黏,克服黏性问题有2种方法: (1)离心裂解液lOOOOOg,20 min,除去DNA; (2)超声破碎裂解细胞,每次超声15?30s,共4次,每次之间将样品在冰上放置15s。 3.在95°C水浴加热样品5 min。 4.20000 g离心5 min。 5.转移上清到一个新管中。 6.样品(上清)现在可以用于电泳(见方案1)和免疫印迹(见HarlowandLane,1999)。在免疫印迹研究中,制备培养细胞提取物时,蛋白样品必须满足以下条件: (1)溶于适合凝胶电泳系统的溶液中(如,溶液的pH值应该在7.0左右,并且盐浓度为200 mmol/L左右); (2)蛋白浓度不能超过特定凝胶系统的承载能力(凝胶电泳变量的讨论见第2章)。对于传统凝胶,小胶的每个泳道的上样量不能>150ug 的总蛋白。
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实验方法原理 |
通过来自增压舱中的氮气减压膨胀来破碎细胞是一种快速、有效的细胞和组织的匀浆方法,能释放完整的细胞器和制备细胞膜(Hunter and Commerford,1961)。该方法的原理很简单:细胞放在一个压力舱中,在高压下(约5500kPa,相当于800psi)氮气首先被溶解在细胞中,当压力突然消失时,氮从溶液中迅速气化,并引起细胞膜的拉伸和扩展,使之破裂,释放出细胞内容物。氮舱减压法适用于哺乳动物和植物细胞,以及一些细胞壁经过处理的细菌。但是这种方法在裂解酵母、真菌孢子或有坚硬细胞壁的细胞时效率较低。氮舱减压法的特征如下: 1.这是一种匀浆或分离细胞组分的温和方式,因为它施加于酶和亚细胞组分的化学和物理压力与其他超声波和机械匀浆的方式相比,是最小的。例如,从大多数类型的细胞中均可释放出功能完整的核和线粒体。 2.与许多依赖压力和摩擦力的细胞裂解方法不同的是,氮减压膨胀法不会产生热,因为这种方法通过隔热膨胀来冷却样品,而不是加热它。因而,蛋白和细胞器没有热损伤。 3.通过使用惰性气体氮气,可以保护任何不稳定的组分免于被氧化,而且氮气不会改变悬浮介质的pH值。 4.该过程快速并且均一,因为在每个细胞上和整个样品中施加了同样的破坏力,保证可重复产生无细胞的匀浆液。 5.大多数的市售产品都适用于很大的样品体积范围(如从约1ml到1L或更多)。 本方案改编自Konte Glass公司的“用户使用说明”,是为使用Kontes Mini Bomb细胞破碎舱来裂解小体积(1~15ml)组织培养细胞而设计的(见图3.2)。
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实验步骤 |
1.确保出口关闭(但不要过紧),并把装置放入冰中预冷(如果有必要)。 2.准备要破碎的细胞或组织。 贴壁培养的细胞:用磷酸盐缓冲液(PBS)温和地洗细胞2?3次,用橡胶细胞刮刀,把细胞从培养器皿中刮到PBS溶液中。 非贴壁培养的细胞:400g离心10min,收集细胞,用PBS洗细胞2~3次。 动物组织:用机械匀浆器,纱网或过滤筛过滤,将组织绞碎。 3.4C条件下480g离心5min收集细胞。 4.去掉上清液,用10倍体积(约15ml)的匀浆溶液重悬细胞,然后转移上清至一个塑料烧杯(含有磁力搅拌棒)中,温和地搅动、混匀,以获得均一的悬浮液。 5.从冷却的细胞破碎舱中旋转、托出过滤支架。 6.在细胞破碎舱中加入15ml的细胞悬浮液。 若体积较大,可以用较大型号的破碎舱,也可以使用其他的氮气压力舱。 7.复位过滤支架。 8.通过拧紧压力舱顶部的螺丝,使之与无氧氮源连接起来,该螺丝应该已经连接在氮源上,只需一个扳手即可。 9.最好在低温下更换压力舱。 10.让氮气从汽缸流人破碎舱,加压到预期值。 必须有压力计显TK压力舱内的压力。所需的压力取决于要破坏的细胞的类型。一般使用的压力为: (1)KB(人类口腔上皮癌细胞)细胞500psi(相当于3.45MPa) (2)大鼠肝细胞500psi(相当于3.45MPa) (3)鸡红细胞1OOOpsi(相当于6.9MPa) 每一次实验,步骤10必须选择最合适的预期值。一般,低压能更大程度地获得完整的细胞器,而高压则使匀浆更为彻底。难以裂解的细胞则需要多次处理,以获得更彻底的匀浆。破碎不同细胞所需的有效压力在表3.6中示出。
11.将加压装置至少平衡30min,以便使氮气溶解并在细胞内达到平衡。在这期间用磁力搅拌器温和地搅动1~2次,或间断地温和晃动,以确保细胞处在均一的悬浮液中。 12.把收集容器(如烧杯)放在出口旁,并冰浴。 13.维持压力装置的工作状态(保持压力),缓慢打开出口,直到细胞悬浮液开始流人已经冷却的收集容器,在所有的悬浮液流尽之前要维持压力。 合理的流速是每秒3~10滴。当开始流出泡沫,表明装置内的液体几乎流完,同时会伴有微弱嘶嘶声。 随着压力的释放,细胞就会破裂,但是通过出口的微孔也会帮助细胞裂解。
14.在对匀浆液离心或是后续操作之前,必须先温和地搅动,以消退泡沫。 15.关闭出口,但不要拧得太紧。 16.关闭氮源。 17.打开出口放气,并排空。当压力舱中的压力回复到大气压后,打开压力舱取出剩余的样品并彻底清洁压力舱。
使用氮舱减压法破碎细胞的推荐工作参数如表3.6。
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实验方法原理 |
利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。为了检测诱导和重组蛋白的表达水平,评估方法的快速简单是很重要的。本方案使用 0.5% TritonX-1OO 裂解细胞,小量制备细菌提取物。
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实验步骤 |
1.室温离心 1min,从 1ml 培养物中收集细菌。 2.去除上清,用 1ml 预冷的 0.5%(体积分数)TritonX-100 重悬细菌细胞的沉淀物。 3.超声波处理悬浮液,3 个循环,每次 20s。超声间隙把细胞放在冰上冷却。 4.将悬浮液在小型离心机中离心 lmin。 5.在上清液中加入 Lammli 样品缓冲液(含有 100 mmol/L DTT)。混合物煮沸 2 min,用分析级 SDS-PAGE 分析目的蛋白(见方案 1)
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实验方法原理 |
利用细菌获得用于纯化的重组蛋白是非常方便的。适用于细菌细胞蛋白提取的方法包括超声波处理、玻璃珠研磨、钒土或石英砂研磨、French 加压罐高压剪切细胞和溶’菌酶处理。这些方法适用于从各种革兰阴性菌和革兰阳性菌中制备蛋白提取物。通常是使用酶的方法破坏细胞,因为细胞在悬浮液中能获得相对均一的处理。下面讲述酶裂解 E.coli 的方法。
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实验步骤 |
1.4°C、3000 g 离心 15 min 收集细菌。 2.用裂解缓冲液洗细胞,除去残留的培养基。重复步骤1,离心收集洗过的细胞。 3.倒出上清,称沉淀的湿重。 4.每克细胞沉淀用约 3 ml 裂解缓冲液重悬,4°C 条件下搅动悬浮液 30 min。如果沉淀物在 30 min 后没有完全悬浮,用韦林搅切器低速混合悬浮液 1min。 5.加溶菌酶至终浓度 1g/L,并在 4°C 条件下孵育 35 min,温和振荡。 增加溶菌酶的浓度至 10 mg/ml,可以加速裂解。如此,在 4°C 条件下,5 min 就可以获得充分的裂解(Bollag,etal,1996)。 6.按顺序加人如下试剂: NP-40 至终浓度 5 g/L MgCh 至终浓度 5 mmol/L DNase I 至终浓度 40 ug/ml 4°C 搅动悬浮液 30 mm,除去黏性的核酸。 细菌提取物包含 40%~70% 蛋白、10%~30% 核酸、2%~10% 多糖和 10%~15% 脂类(Worral,1996)。细胞裂解过程中 DNA 的释放经常导致提取物高度黏稠,这可能在接下来的层析纯化步骤中引起严重的麻烦。除了用 DNase I 处理外,也可以加人带正电荷的化合物,如鱼精蛋白硫酸盐 (至 5 mg/g 沉淀湿重)(Scopes,1994) 或聚乙稀亚胺,通过中和溶液来除去细胞提取物中的 DNA(还伴有其他核酸,在一些情况下,还有高度酸化蛋白)(BurgossandJendrisak,1975)。
7.悬浮液在 4°C 条件下 23000 g 离心 30 min。 8.用含有 DTT 的 Laemmli 缓冲液重悬一小部分沉淀。 9.利用分析级 SDS-PAGE 分析可溶性蛋白组分(上清)和沉淀组分,找出目的蛋白存在的位置(见方案 1)。 如果目的蛋白位于难溶的沉淀组分中,则可能是形成了包含体,那么目的蛋白就需要依照实验方案 7 来溶解和纯化。若目的蛋白位于上清中,则将其贮存于 4°C,以备后续纯化方案使用。
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实验方法原理 |
由于分子克隆技术能够使细菌高水平表达蛋白,因此原核表达是一个非常便利的获得重组蛋白的系统。遗憾的是这些蛋白在细菌中易于聚合和沉淀,形成难溶解的包含体,因而很难纯化。非细菌蛋白的包含体尤其普遍。虽然没有一种可用于所有蛋白的普适方法,还是有许多策略适用于包含体蛋白的溶解。本方案描述的就是这些策略之一。溶解包含体蛋白时要考虑许多步骤: 1.细胞裂解; 2.包含体的分离; 3.洗涤包含体; 4.溶解包含体; 5.重组蛋白的复性(假如需要)。 首先,在溶解之前洗涤包含体对于除去非目的蛋白和非蛋白物质是很重要的一步。比如,用1 mol/L的盐酸胍洗涤包含奋可以从重组蛋白IL-2(Weir,etal,1987)中除去污染蛋白,而4.0 mol/L 脲可用来洗涤IL-6包含体(Zhang,et al,1992)。除去非蛋白物质(类脂)也是很重要的,这可以防止RP-HPLC层析柱被阻塞,延长层析柱的使用寿命。这可以通过用4.O mol/L脲(Zhang,etal,1992)洗包含体或用正丁醇 10 mmol/L EDTA(Weir,et al,1987)提取包含体来加以解决。然而由于空气的氧化作用,一些目的蛋白将重折叠(如IL-6,[Zhang,etal,1992])。诱导蛋白正确折叠的常用方法是在有硫醇试剂(如1mmol/L DTT)存在的条件下,通过稀释和透析来逐渐降低去垢剂的浓度,促使二硫键的正确形成。
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实验步骤 |
1.如实验方案6所述裂解细胞。 2.4°C 条件下23000 g离心细胞裂解液30 min。 3.倒出上清,测定沉淀的湿重。 4.用约 10倍体积的洗涤缓冲液重悬沉淀,室温搅动悬浮液lh。 5.4°C条件下23000 g 离心混合物30 min。 6.除去上清,并重悬沉淀。 7.重复4~5步骤3次以上(直到重组蛋白的纯度>80%,用分析级 SDS-PAGE 来判断)。 8.溶解步骤7的沉淀物,每克湿重沉淀(由步骤3决定)加人约 8 ml 的溶解缓冲液,在 4°C条件下温和搅动混合物 16~20 min。
其他的溶解缓冲液: (1)8mol/L 盐酸胍,10 mmol/L DTT,50 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 每 12~15 g 湿重的收集细胞用 15 ml 溶液溶解。37°C 孵育混合物 1h (Weir,et al,1987)。如步骤9(1) 所述变性蛋白。 (2)8mol/L脲素,2 mmol/L 还原型谷胱甘肽/0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽。 每克湿重包含体沉淀使用 9 倍体积的缓冲液。室温孵育混合物 lh。蛋白浓度不要超过 2.5 mg/ml(Bollag,et al,1996)。如步骤9(2) 所述复性蛋白。 9.特定目的蛋白的重新折叠所需的最适条件必须通过预实验来选择。复性条件包括: (1)用 1.5/mol/L 硫酸铜、50 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 溶液将可溶性沉淀稀释 25 倍,至终浓度为0.04 mol/L DTT、0.24mol/L 盐酸胍和约1.4 ug/ml 的目的蛋白(Weir,et al,1987)。20°C 孵育混合物 2 h。 (2)缓慢将 9 倍体积的 50 mmol/L 磷酸盐、50 mmol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA(含 2 mmol/L 还原型谷胱甘肽/0.2 mmol/L 氧化型谷胱甘肽)加人溶解的沉淀中。25°C 孵育混合物 2?4 h。 10.用适合于目的蛋白的浓缩步骤来回收重折叠的蛋白(如 RP-HPLC、冻干或超过滤)。
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实验方法原理 | 由于酵母的经典遗传分析和分子遗传分析都已经研究得非常透彻,因而对于纯化重组动物蛋白来说,酵母是一个很有吸引力的表达体系。关于培养和收集酵母细胞的讨论,尤其是芽殖酵母,参见 Jazwinski(1990)。酵母细胞的裂解方法有很多种,包括自溶、压力破碎(如 French 加压罐)、研磨(玻璃珠振荡)和酶裂解(如 Zymolase) 等。本方案讨论的振荡玻璃珠研磨,是最简便的方法之一。这对于小体积(如 <1ml, 使用微量离心管)和数升的体积(使用特制的DynoMill仪器)都是很有效的。经相差显微镜检测,细胞破碎率一般>95%。 |
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实验步骤 | 1.在微型离心机上离心 3 mm,以收集细胞。 2.去上清,用 PBS 重悬细胞,再离心 3 min。 3.去上清,估算细胞沉淀的体积,向细胞沉淀中加人 3 倍体积的冰浴裂解缓冲液,悬浮后置于冰上。 4.加入等体积的预冷玻璃珠。 5.剧烈振荡悬浮液 30s。 6.重复步骤5,并在相差显微镜下观察,直到大部分酵母细胞被裂解。 7.4°C 条件下在小型离心机中离心悬浮液 5 min, 8.小心地倒出上清,并转移到另一管中,置于冰上备用。 |
实验方法原理 |
差异去垢剂分离法(differential detergent fractionation, DDF) 包括使用一系列含不同去垢剂的 PIPES 缓冲液对细胞进行连续抽提,首先是毛地黄皂苷,其次是 Triton, 最后是 Tween/脱氧胆酸盐。这些步骤产生 4 种在生化和电泳上相异的组分 (见图 3.3 和表 3.7)。包括: 1.胞质蛋白和可抽提的细胞骨架组分。用镁沉淀的方法可以从这个组分中初步纯化出微管组分(见本方案的附加方案:用镁沉淀微管蛋白和微管结合蛋白)。 2.膜和细胞器蛋白。使用 TritonX-114 可以富集完整的膜蛋白(Bordier,1981;Pryde and Phillips,1996)。 3.核膜蛋白和可抽提的核蛋白。 4.抗去垢剂的细胞骨架纤维和核基质蛋白。骨架结合蛋白及其相互作用可进一步用不同浓度的脲来抽提、分析。 此处所述的 DDF 方案改自分离 Madin-Darby 犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK) 细胞组分的方法(Fey,et al,1984)。其中的改动包括增加毛地黄皂苷提取步骤,在毛地黄皂苷和 Triton 缓冲液中加入 EDTA,并去掉了核酸酶消化步骤(在有 SDS 的存在下,DNA 被强力变性)。总 RNA 也可以用常规方法从每个变性组分中分离,并进行 Northern 杂交分析来观察 mRNA 的动态(见附加方案:去垢剂提取物中 RNA 的分离)。该方案和附加方案均由 MelindaRamsby 和 GregoryMakowski(UniversityofConnecticutHealthCenter) 友情提供。
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实验步骤 |
一、细胞制备1.在冰上预冷细胞培养物,然后用冰浴的盐溶液、PBS 或其他的非变性缓冲液洗 2~3 次。 保存 1 份洗涤缓冲液(贮存在-70°C) 以备将来进行样品校正,或用于酶、蛋白或 RNA 分析的对照材料。 2.选择下面合适的方法来处理悬浮液或单层培养物。 处理悬浮培养物:悬浮培养的细胞所需的 DDF 体积取决于细胞的湿重或细胞数量。 (1)转移一小管悬浮培养物到已称重的塑料小管中,然后短暂地离心; (2)倒出培养基,并称出细胞沉淀的湿重; (3)进行第二部分的第1步。 处理单层培养物:单层培养物所需 DDF 的体积取决于培养细胞的平面区域的大小或细胞数量。 (1)测出培养瓶或培养皿的表面积,或是计算一个有代表性的培养皿中细胞的数目; (2)进行第三部分的第1步。 二、悬浮细胞的去垢剂分离通过连续地加入和去除 DDF 缓冲液来操作 DDF,所有的提取过程都是在冰上进行,并温和地搅动。注意提取次数对重复性是很重要的。提取物在用于实验前应一直放在冰上,或冰冻保存(最好是一 70°C)。测出每一种去垢剂提取物的回收体积,并计算净产量或分布百分比。每一种 DDF 缓冲液,都应保存一小管,以备将来进行样品校正,或用于实验的对照材料。 1.每克(湿重)洗过的细胞沉淀中加入 5 倍体积冰冷的毛地黄皂苷提取液缓冲液。温和地旋转,重悬细胞沉淀。 2.冰浴条件下在台式混合器上温和地晃动,直到被通透化(permeabilized) 的细胞达 95%~100%(约 IOmin)(用台盼蓝染色排除法估计)。
3.480 g 离心提取混合物 10 min。 4.转移上清到另一干净的试管中。测定上清(胞质组分)的体积后,把胞质组分分装到几个小管中,并把它们存在一 7℃ 条件下。此为 CYTO 组分(见图 3.3 和表 3.7)。 5.用 5 倍沉淀体积(相对于细胞沉淀的最初重量 [由第一部分第2步所决定]) 的冰浴 TritonX-IOO 提取缓冲液仔细地重悬毛地黄皂苷不溶的沉淀,以获得均一的悬浮液。 在 DDF 这一方案中,TritonX-114 可以替代 TritonX-100,双向凝胶电泳分析提取组分的结果表明二者没有明显的区别。相对于 TritonX-100,TritonX-IU 具有更低的熔点(TritonX-100 熔点为 60°C;TritonX-114 熔点为 20°C),并在非变性温度下可以将样品分为高脂相(lipid-richphase) 和低脂相(lipid-poorphase), 因而可以对膜整合蛋白和膜外周蛋白,以及可溶的细胞器内含物进行亚组分分离。 6.冰浴条件下在台式混合器上温和地晃动细胞 30 min。 7.5000g 离心提取混合物 10 min。 8.转移上清液至另一个干净试管中,测量上清液(膜、细胞器组分)的体积,分装后在一 70°C 条件下贮存。此为 MO 组分(见图 3.3 和表 3.7)。 9.Triton 提取残渣用 Tween-40/脱氧胆酸钠提取缓冲液重新悬浮,其体积为 Triton 提取(第⑤步)时所用体积的 1.5 倍。使用特氟隆(Teflon) 滑壁玻璃匀浆器 (smooth-walledglasshomogenizer),以中等速度研磨介质 5 次,使沉淀重新悬浮。 10.6780 g 离心抽提混合物 10 min。 11.转移上清液至另一个干净试管中,测量上清液(核组分)的体积,分装核组分后于一 70°C 条件下贮存。此为 NUC 组分(见图 3.3 和表 3.7)。 12.将含有 1.2 mmol/LPMSF 的冰浴 PBS(pH7.4) 加到抗去垢剂沉淀中,使用 Teflon 研磨 3 次以重悬沉淀,然后 12000 g 离心 1Omin, 收集沉淀。 13.重复步骤12两次以上,以彻底清洗沉淀。 14.去上清,用 90% 丙酮(一 20°C 预冷)洗沉淀一次。 15.过夜冻干沉淀(细胞骨架/核基质组分)。 16.在已知重量的离心管中测出沉淀的重量,于一 70°C 条件下贮存样品。此为 CSK/MAT 组分(见图 3.3 和表 3.7)。 通常情况下细胞悬浮液的 CSK/MAT 组分的产率很高。因而,贮存冷冻干燥的沉淀组分更为方便,用时只需用非变性的细胞骨架溶解缓冲液来重悬已测定过重量的沉淀。 17.进行第四部分的操作。 三、单层细胞培养物的去垢剂分离通过连续地加人和去除 DDF 缓冲液对 DDF 进行操作。所有的提取过程都是在冰上进行的,并温和地搅动。注意提取次数对重复性是重要的。实验前,提取物应维持冰浴,或冰冻保存(最好是-70℃)。测出每一组去垢剂提取物的回收体积,并计算净产量或分布的百分比。每一种 DDF 缓冲液要保存一小管以作随后的样品校准或作为实验的对照材料。 1.直接加 1ml 冰浴的毛地黄皂苷提取缓冲液到 T-25 培养瓶中的单层培养细胞上。 典型的 T-25 培养瓶能容纳约 5X1O6 个细胞。T-75 培养瓶或 100 mm 培养皿应加人 3 ml 的毛地黄皂苷提取缓冲液。 2.冰浴条件下在台式混合器上温和地晃动细胞悬浮液,直到 95%~100% 的细胞被通透化(约 1O min)(用台盼蓝染色排除法 [Trypan blue exclusion] 检测)。
3.倾斜培养瓶,将液体(胞质组分)倒入一个小的培养會。残余溶液用吸管转移入培养管中。测定胞质组分的体积,分装后在一 70°C 条件下贮存。此为 CYTO 组分(见图 3.3 和表 3.7)。 4.每个 T-25 培养瓶(约 5X1O6 个细胞)中加入 1ml Triton 提取缓冲液。 在 DDF 这一方案中,TritonX-114 可以替代 TritonX-100,双向凝胶电泳分析提取组分的结果表明二者没有明显的区别。相对于 TritonX-100,TritonX-114 具有更低的熔点(TritonX-100 熔点为 60°C;TritonX-114 熔点为 20°C), 并在非变性温度下可以将样品分为高脂相(Hpid-richphase) 和低脂相(lipul-poorphase), 因而可以对膜整合蛋白和膜外周蛋白,以及可溶的细胞器内含物进行亚组分分离。 5.冰浴条件下在台式混合器上温和地晃动细胞 30 min。 6.倾斜培养瓶,将液体(膜和细胞器组分)到入一个小培养管中,残余溶液用吸管转移人培养管中。测定该组分的体积,分装后在一 70°C 条件下贮存。此为 CYTO 组分(见图 3.3 和表 3.7)。 7.每个 T-25 培养瓶(约 5XIO6 个细胞)中加入 0.5?I.0 mlTween-40/脱氧胆酸钠提取缓冲液体来提取单层细胞。 8.倾斜培养瓶,将液体(核组分)到入一个小培养管中,残余溶液用吸管转移入培养管中。测定核组分的体积,分装后在一 70°C 条件下贮存。此为 NUC 组分(见图 3.3 和表 3.7)。 9.用 PBS 在原位浸没单层细胞。 10.向培养瓶中加入 1?3 ml 的无/3-巯基乙醇的非变性细胞骨架溶解缓冲液,对抗去垢剂残渣进行提取。倾晃培养瓶以悬浮残渣。测量体积(细胞骨架和基质组分),分装后在一 70°C 条件下贮存。此为 CSK/MAT 组分(见图 3?3 和表 3?7)。 非变性细胞骨架溶解缓冲液的体积取决于细胞类型和培养时间(即胞外基质的量)。一般,1~3 ml 是合适的范围。 11.进行第四部分的操作。 四、蛋白浓度的测定1.在冰上融化去垢剂缓冲液和提取物。 2.用水稀释毛地黄皂苷/EDTA 和 Triton/EDTA 提取物(对于悬浮培养物的提取物加入 4 倍体积的水,单层培养物的提取物中加人 2~3 倍体积的水)。Tween/DOC 提取物则不用稀释。 3.在无β-巯基乙醇的细胞骨架溶解缓冲液中溶解冷冻干燥的 CSK/MAT 沉淀。每 1Omg(干重)沉淀使用 1ml 缓冲液。如果需要可以对单层培养物的 CSK/MAT 进行稀释。 4.每个样品取 20~50ul,用 BCA 方法(见附录 2) 测定,重复两次。 另一种测定蛋白质浓度的方法是 Peterson 的福林(Folin)-酸法 (1983),该方法对于去垢剂的干扰不敏感。建议不使用标准的 Lowry 方法,因为在实验中会有由垢剂诱导的凝聚发生(M.Ramsby,未发表)。 五、使用双向凝胶电泳分析蛋白质组分不同细胞类型的 DDF 样品可用于二维 PAGE 分析,包括 IEF 和非平衡 pH 梯度电泳(nonequilibriumpHgradientelectrophoresis,NEpHGE)。有关双向凝胶的例子,参见 Ramsby 等(1994) 以及 Ramsby 和 Makowski(1999)。新鲜的或融化的 DDF 提取物(置于冰上)首先要标准化,使蛋白含量相同,然后添加固体脲至终浓度 9.5mol/L0 1.对于 100ul 的样品,加入 85 mg 脲和 15ul 10xO’Fairell 裂解缓冲液,加热至室温作用。 2.对于干燥的 CSK 提取物,可在 IXO7FarreIl 裂解缓冲液中直接溶解(O’Farrell,1975;O’Farrell,et al,1977)。 3.对于非还原 SDS 缓冲液中的 CSK 提取物,通过加入固体脲和加入 1OXO’Farrell 裂解缓冲液,至终浓度 9.5mol/L。 加固体脲和 1OXO’Farrell 裂解缓冲液,以便尽可能地减少由稀释带来的影响,并尽可能地检测低丰度蛋白。稍微加热样品有利于脲的溶解,但是避免过热(增加温度/或延长加热时间),否则可能会导致人为的氨基甲酰化。 4.使用 2D 电泳分析 DDF 样品(有关方法参见 O’Farrell,1975;1OXO’Farrell,etal,1977; 或参见第 4 章)。 5.LEF 凝胶(见第 4 章)含有 3.5% 两性电解质(2% 对应 PH5~8,1% 对应 pH3?10,0.5% 对应 pH2~5),样品需要电泳 9800V.h, 其中在最后 1 个小时用 800V 聚焦(Duncan and Hershey,1984;Ramsby,etal,1994)。 6.NEpHGE 凝胶含有 2% 两性电解质(PH3~10),样品需电泳 2400V.h(Ramsby,etal,1994)。 通常在 15~60 沁的样品含量达到 25~1OOyg 的蛋白,就足以通过考马斯亮蓝或放射自显影观察到;低丰度蛋白可通过银染检测到。实验表明,样品中的去垢剂缓冲液的体积多少不会对 IEF 凝胶 pH 梯度的线性范围产生不利的影响。但是,含有 Tween/DOC 的样品可能引起向低 pH 的轻微漂移。
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