原位杂交的基本操作方法(图 14 .2 ) 演化自 Southern 杂交:标底是玻片上的染色体和细胞核,探针是带标记的待测 DNA 序列 [ 本书中即是转基因和对照,图 14.3(a) ]。对探针和染色体分别或同时进行变性处理,以便产生杂交分子(图 14.2)。多数实验方案采取杂交过夜的方式,这对于低拷贝 FISH 非常重要。而对检测重复 DNA 序列,杂交时间有几小时就足够了。正如 Southern 杂交一样,需要经过数次的洗涤,目的是去除未结合的探针并鉴定杂交的紧密性,也就是鉴定探针和目的 DNA 序列的相似度,而这是在一个双链 DNA 螺旋中保持稳定杂交的必要条件。为了准备染色体,除了杂交温度、钠离子浓度和洗涤液等条件外,一种双螺旋去稳定剂如甲酰胺也可以调控杂交紧密度。在直接 FISH 技术中,染色体可以马上复染,常用 DAPI 复染;在使用荧光素和地髙辛标记的非直接性 FISH 中,需要使用免疫细胞化学的方法做检测。
制备含有大量干净而铺展的分裂中期染色体,是保证 FISH 和染色体染色成功的重要因素。用于固定和染色体制备的植物材料必须是健康、无病害并生长旺盛的。它可以是任何分生组织,但在转基因植株生长过程中,用什么材料做检测,则取决定于试验的时间,可以取幼苗的根尖、盆边缘老株上新长的根尖,或者水培植株的根尖。对某些物种来说,也可以选用嫩枝、叶片或新芽的分生组织细胞。
在多数情况下,获得最大数量的分裂中期的染色体对试验成功是很重要的。为了获得更多的处于分裂中期的细胞,常常需要对材料进行预处理,使染色体发生浓缩,并破坏纺锤体微管,以获得充分分散的染色体。纺锤体微管抑制剂,如秋水仙素 ( 广泛用于染色体计数)可以形成高度浓缩的染色体,另一些染色体浓缩剂,如冰水或者 8- 羟基喹啉,能产生更为伸展的染色体,以更适合于 FISH 分析。
因为基于随机引物法或缺口前移原理的相关操作说明在商用试剂盒已有提供,本章不再讲述标记 DNA 的实验操作方案。直接 PCR 标记法也是常用的方法,这种方法是在扩增克隆的特定片段,或扩增总基因组 DNA 的特定片段时,结合引入带标记的分子。
为保证 FISH 的成功,必须在探针中引入比例合适的带标记分子,以便于检测。为使聚合酶作用更有效,带标记的核苷酸(dUTP 或 dCTP ) 与非标记 TTP 或 CTP 按 1 :2 混合。试剂生产商常常提出标记核苷酸的推荐浓度和稀释度,以获得最佳整合效率。这是一个标准实验的起点要求量,不过一些非常昂贵的标记核苷酸,尤其是刚打开的还未经多次冻融的试剂,其用量可以减少至推荐用量的 50%~70%。另一个重要因子是标记后探针的长度。探针不能太长,一般是 200~600 bp,以免不能渗透进染色体的 DNA 中。随机引物法和缺口前移法产生的探针长度恰好适宜于 FISH,不过,有时可能需要对缺口前移酶体系中的 DNA 酶组分加以调整。用 PCR 法标记较大的插入克隆,可能不会得到好的探针。
另一个影响标记成功与否的因素是模板 DNA 的纯度,以及用于加标记的 DNA 模板序列的长度。使用克隆片段时,要确保小量制备的 DNA 是纯净的、未受细菌污染,这样插入片段才能被干净、完整地酶切。对较小的插入片段(100 bp 到 2 kb ) ,推荐使用 M13 测序通用引物进行 PCR 扩增,这样能获得非常纯净的模板 DNA。在用随机引物法或切口前移法进行标记前,最好将 PCR 产物经电泳后割胶回收目的条带,以纯化模板 DNA。对较长产物,小量提取的 DNA 可以在质粒线性化或酶切目的片段后直接标记。
不过,我们发现大的 DNA 分子常常不会是很好的模板,可能的原因是,如果聚合酶不在 DNA 模板分子的末端停止,酶就无效了。因此,将大 DNA 分子通过超声、加热或者酶切的方法处理后,再进行标记效果会更好( 见 [ 4 ] 、[ 1 9 ] ) 。
检测转基因片段时,推荐使用生物素标记法 [ 图14.3 (a ) ] ,因为生物素是最小的半抗原,通常最易整合,市场上也有销售专用的生物素试剂盒。其次,许多不同的亲和素、链霉亲和素或者抗生物素抗体,能与荧光染料紧密而稳定的连接,这些都可以从市场上购得( 如 Alexa dyes和 Molecular Probes公司)。作为第二对照或者指示探针,可用地高辛或直接荧光染料标记,建议使用 5S rDNA,因为它广泛存在,并且在许多物种中都有主荧光和次荧光位点 [ 图 14.3 ( a ) ] ,能提供最好的 FISH 实验对照。45S rDNA 也可以使用,但是常常有强荧光位点出现,其荧光信号强过转基因的杂交信号。另一个非常好用的是重复 DNA 序列,它可以帮助鉴定染色体。
大多数样品需要进行 DNA 复染来观察染色体。复染染料颜色必须与探针颜色不同,其信号也不能太亮使杂交信号模糊。因此,建议先染色再封片。一些实验操作将复染和封片合并为一步,这样做省了一个步骤,但是可能导致染色过度和背景值偏高。第一个荧光 FISH 实验使用碘化丙啶染色,当用蓝光或者绿光作为激发光时,染色体呈红色。
双靶标 FISH 实验中,当用红色和绿色标记荧光探针时,使用 DAPI 在紫外激发下呈蓝光比较合适(图 14.3),因为它常常能同时显示出异染色质带型。在制备染色体过程中, DAPI 也是一种检测染色体的质量和数目的很好染料,当染色体很小时它特别有用 [ 图 14.1 (a ) ] 。