标签: 石蜡切片 苏木精-伊红 神经生物学实用实验技术第二章第二节
石蜡切片制作可以用于:(1)保持细胞间的正常的相互关系,能较好和较长时间地保留细胞的原貌。(2)是光学显微镜的主要制片方法。
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石蜡切片是最基本的切片技术,冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法(简称 H.E. 对染法)是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各种固定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过 HE 染色,细胞核被苏木素染成蓝紫色,细胞质被伊红染色呈粉红色。
一、试剂配法1.中性甲醛固定液:甲醛(37%-40%,市售,本所购买即为此浓度) 100mL磷酸氢二钠 6.5磷酸二氢钾(钠) 4g双蒸水 900mL2.苏木精、伊红染色液为碧云天产品3.1%盐酸乙醇液盐酸 1份70%酒精 100份4.甘油蛋白贴片剂:蛋白 50 ml甘油 50 ml水杨酸钠(防腐剂) 1g配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中,去蛋黄留下蛋白,用玻棒调打成雪花状泡沫,然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中,经数小时或一夜,即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油,稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂(水杨酸钠)作防腐用。可保存几个月。二、实验步骤1.取材颈椎脱臼法处死小鼠,打开腹腔,剪取肝组织(或其他组织)。切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织,切成一小块2-3mm厚。注意事项:(1)取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。2.固定将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下,立即投入中性福尔马林固定液中固定,固定30-50min。注意事项:(1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。(2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。(3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。(4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。3. 洗涤材料经固定后,流水冲洗,数小时或过夜。4. 脱水材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水,各30min,再放入95%、100%各2次,每次20min。各注意事项:(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。(2)在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。(3)在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。(4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。(5)如需过夜,应停留在70%酒精中。(6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象5.透明纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min(至透明为止)。由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。透明注意事项(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。(2)更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气。(3)在透明过程中, 如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。6.透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55-60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。透蜡注意事项(1)尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度;(2)透蜡温度要恒定,不可忽高忽低;(3)操作要迅速,力求在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。7. 包埋包埋时,用镊子夹取石蜡模子(金属质地)在酒精灯上稍加热,放在平的桌面上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热,夹取材料将切面朝下放入蜡模中,排列整齐。再放上包埋盒,轻轻倒入熔蜡。8. 切片(1)将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。(2)将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。(3)摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。(4)调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成15度左右。(5)调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为4-10微米。(6)一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40-50r/min。(7)切成的蜡带到20-30cm长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。(8)用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。(9)切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。9. 展片、贴片打开水浴锅,使水温维持在40-45℃,另准备30%乙醇溶液。(1) 切片时,将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。(2) 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在乙醇溶液的水面上,使切片展开。(3)小镊子轻轻地将连在一起的切片分开,用一个载玻片将切片完整,已展开的切片捞至温水中,使之充分展开。(4) 另取洁净的载玻片,捞起展开的切片,使其位于切片1/3处,另一端(磨边,粗糙的一端)磨面上标记或贴上标签,放于切片架上。10. 脱蜡复水将水浴锅温度调至60℃,待水温控制在60℃时,将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内,放入水浴锅中,盖上盖子(可密封),30min至蜡熔化。之后,石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min,然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3-5min,再放入蒸馏水中3min。11. 染色切片放入苏木精中染色约10-30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。12.水洗用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可),但要注意流水不能过大,以防切片脱落。13.分化将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色,约2秒至数十秒钟。见切片变红,颜色较浅即可。14.漂洗切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。15.脱水Ⅰ切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。16、复染用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。伊红主要染细胞质,着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合,如果细胞核染色较浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。17.脱水Ⅱ将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色,然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。18.透明切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。19.封藏:中性树胶封存因切片经二甲苯透明,使用中性树胶作为封藏剂,树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。封藏的方法:封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。
1、苏木精染色后,分色是至关重要的,应该在显微镜下进行。一般以细胞核染色比较清晰,细胞质等基本无色为宜。如发现过染,可以延长分色时间,若染色太浅,则应重新进行染色后再分色。
2、如发现伊红染色过深,可延长在95%酒精分色时间。
3、切片经酒精脱水后,如在转入二甲苯时有混浊现象产生或呈白色不透明状态,说明脱水不彻底,应立即将切片退回无水酒精重新脱水,如仍出现浑浊现象时则应更换无水酒精。
4、染色各步骤所需的时间,常受温度、切片厚度等影响,可根据镜下观察所见予以调整。
5、染色反应不正常,应检查染液及试剂是否失效或误用。
石蜡切片可能产生的问题和解决方法
缺点一:石蜡带弯曲不直
原 因:
1.石蜡块上下两边不平行
2.石蜡块的上下两边不和刀口平行
3.刀口锋利不一,局部产生差异
4.蜡块的一边较另一边为软,或两边的硬度不一致
5.材料未居蜡块正中央
6.材料大而形不正
补救办法:
1.取下台木,将两边修干
2.调节标本台,使两者平行
3.移动刀片,改用新的刀口
4.待蜡块冷却后再切,或重新包埋
5.用刀片切去部分石蜡,使材料居中
6.在大的一边切去少许石蜡
缺点二:切片分离、不能连成带状
原因:
1.室温过低
2.石蜡过硬
3.材料边缘留蜡太少
4.刀的角度不适合
补救办法 :
1.在切片机上方开一电灯或提高室温
2.在蜡块面加一层45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面
3.重新包埋
4.矫正刀的角度
缺点三:切片卷起呈圆筒状
3.刀口太钝
4.刀的倾角太大
1.提高室温
2.加软蜡
3用毛笔将蜡片摊开压住,切2—3 片即成带
4.减小倾角
缺点四:切片粘附于切片刀,皱摺在一起
1.室温过高
2.石蜡过软
3.刀口上留有一层石蜡
4.刀口钝
1.降低室温
2.将蜡块投入凉水中稍浸耒—增加
3.切片厚度,改用硬蜡包埋,用二甲苯拭去刀口的石蜡
4.磨刀或移动刀口
缺点五:切片纵裂
1.刀有缺口
2.石蜡块中含有颗粒、杂质
3.刀口留有碎屑或细丝
4.组织太硬
1.可移动刀口
2.将颗粒拽去
3.清洁刀口
4.让包埋块在水中浸泡
缺点六:切片有横纹
1.刀和台木的固定螺丝太松
2.刀口倾斜度太大
3.刀口有石蜡屑
补 救 办 法 :
1.旋紧螺旋
2.可放平1—2。后再切
3.用氯仿拭去
缺点七:切片厚薄不匀
1.切片机有毛病
2.夹刀不当
3.未旋紧标本台螺旋
4.石蜡块过硬
1.矫正切片机装置
2.对症治疗
3.旋紧螺旋
4.将石蜡块在水中浸泡
缺点八:每张切片厚薄不匀
1.刀口震动,是由于材料过硬
2.刀的倾角太大
1.在蜡块表面涂一层火棉胶
2.减小倾角
缺点九:材料发生裂隙破碎或脱落
1.脱水不干净
2.有透明剂残留
3.石蜡透入时,温度过高或时间过长
4.由于脱水剂和透明剂的影响,使组织变硬发脆
5.材料太硬或太粗
1.无法弥补
2.增加浸蜡时间,重新包埋
3.无法补救
4.用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明
5.在蜡块表面涂一薄层火棉胶溶液
缺点十:切片时发生沙沙声
1.组织块过硬
2.包埋温度过高
3.材料内留有结晶体
1.浸泡水中软化
2.无法补救
缺点十一:石蜡块将蜡带抬起
1.由于摩擦而产生静电荷所致
2.石蜡块上面附有石蜡碎屑
3.刀口上附有石蜡碎屑
2.用刀片将碎屑清除
3.用二甲苯或氧仿清除
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