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标签： DNA酶I足迹法 蛋白质结合位点 分子克隆实验指南（第三版）下册 第17章 方案1
本方案介绍在放射性标记的DNA片段上确定蛋白质结合位点的作图方法。本方案使用DNA酶I切割DNA,而在替代方案中是用羟自由基断裂DNA。如果希望得到优化足迹法反应的建议，请参见本方案最后部分的疑难解析以及优化DNA酶I足迹法反应的栏目。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔。
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| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 |
材料 缓冲液和溶液 贮存液、缓冲液和试剂的组成请参见附录 1。贮存液需稀释到适当浓度。 细胞匀浆缓冲液 10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9) 1.5 mml/LMgCl2 10mmol/LKCl 0.5 mmol/LDTT 0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟 含 0.05%(V/V)NonidetP-40 的细胞匀浆缓冲液 细胞重悬缓冲液 40 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9) 0.4mol/LKCl 1 mmol/LDTT 10%(V/V) 甘油 0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟 0.1%(m/V) 抑蛋白酶肽 缓冲液贮存于 0°C 细胞淋洗缓冲液 40 mml/LTris-Cl(pH7.4) 1 mmol/LEDTA 0.15mol/LNaCl 缓冲液贮存于 0°C。 乙醇 Ficoll 400(20%m/V) Ficoll 溶解在无菌水中，分装成 100ul 并冻存在-20°C。 甲酰胺染色液 10 ml 甲酰胶 10 mg 二甲苯青 FF 10 mg 溴酚兰 贮存于室溫。 MgCl2/CaCl2 溶液 10 mmol/LMgCl2 5 mmoI/LCaCl2 溶液过滤除菌并贮存于室温。 NaCl(5mol/L) NonidetP-40(0.05%V/V) 酚：氯仿 不含 Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS) 聚乙烯醇（10%m/V) 聚乙烯醇溶解在无菌水中，分装成 100ul 并冻存在-20°C。 终止液 20 mmol/LEDTA（pH8.0) 1%(m/V)SDS 0.2mol/LNaCl 125ug/ml 酵母 tRNA 组织匀浆液 10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.6) 25 mmol/LKCl 0.15 mmol/L 精胺 0.5 mmol/L 亚梢胺 1 mmol/LEDTA(pH8.0) 2mol/L 蔗糖 10%(V/V) 甘油 该缓冲液在使用前需要冰浴预冷。根据需要，步骤 1 前要加人 0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF)、1ug/ml 亮抑酶肽、1ug/ml 抑胃酶肽等蛋白酶抑制剂。 组织重悬缓冲液 5 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9) 1.5 mmol/LMgCl2 0.5 mmol/LDTT 0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟 26%(V/V) 甘柚 贮存于 0°C。 台盼蓝染料（0.4%m/V) 取一定量的染料溶于不含 Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS) 中。室温贮存。 酶和缓冲液 DNA 酶 I(lmg/ml) 酶溶于 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）, 分装成小份并冻存在-20°C。恰好在步骤 3 以前把溶液以 1:100稀释于冰浴的 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)。 凝胶 6% 或 8% 的变性聚丙烯酰胺测序胶（见第 12 章方案 8) 核酸与寡核苷酸 poly(dI-dC)(lmg/ml) 取一定量 poly(dI-dC) 溶解在无菌水中, 分装成 lOOul 并冻存在-20°C。加入核酸聚合物是为了减少蛋白与放射性标记 DNA 片段的非特异性结合，结合反应中 poly(dI-dC) 的最佳浓度 (通常为 0~100ug/ml) 需要靠经验确定。其他可用于减低非特异性结合的核酸包括剪切过的基因组 DNA(例如来自子 E.coli、鲑鱼精子或小牛胸腺）、tRNA、剪切后或限制性酶切后的质粒 DNA、poly(dA-dT) 和 poly(dG-dC)。 测序胶长度标准品 通常由靶 DNA 片段进行 Maxam-Gilbert 测序实验中的（A+G) 反应组成。化学测序的方法请参见第 12 章的方案 7。此外也可以使用双脱氧终止法测序反应（第 12 章，方案 3~6), 所用 DNA 的 5'端与 DNA 酶 I 切割得到的 DNA 片段的放射性末端相同。 放射性化合物 32P 末端标记的 DNA[长度 200~500bp, 比活性≥2.5X107cpm/ug(≥5000cpm/fmol)] DNA 片段的末端标记可以通过以下方法完成：磷酸化（第 9 章方案 13~16, 或第 10 章方案 2); 用 DNA 聚合酶补平 3'-缩进的末端 (第 9 章方案 10 和 11, 成第 10 章方案 7）；或用末端标记引物进行 PCR 反应（第 8 章方案 1) 后一种方法更为快速，不依赖于限制性酶切位点，并允许 DNA 结合位点位于末端标记有关的多个位置。不管用何种方法作放射性标记，DNA 片段用于 DNA 足迹反应前部需要用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。 反应中使用的 DNA 片段长度应该为 200~500bp。感兴趣的结合位点至少离放射标记末端 30bp。如果使用更长的 DNA 片段，测序胶的分辨率会变弱。结合位点离末壩太近可能不被 DNA 结合蛋白或 DNA 酶 I 识别。 离心机和转头 Beckman SW28 转头或类似产品，预冷到 4°C Sorvall Hl000B 转头或类似产品，预冷到 4°C 特殊设备 沸腾的水浴锅 带 B 型研杵的 Dounce 匀浆器 晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管 橡胶棒 辅助试剂 本方案步骤 7~10 需要列在第 12 章方案 8、11 和 12 中的试剂 细胞和组织 新鲜组织、培养的细胞、来自细胞或组织的蛋白成分  方法 1. 用下列 3 种方法中的一种制备核提取物。此外，纯化细胞蛋白得到的组分可以直接用于步骤 2。 从组织制备核提取物 a. 解剖 10~15 g 组织并剪碎。加入冰冷的组织匀浆缓冲液，使碎组织的体积调整到 30 ml。用带紧型研杵的 Dounce 匀浆器勻浆，直到镜检确定大于 80%~90％ 的细胞已经破碎。 b. 检测裂解情况是用 10ul 细胞悬液加相同体积 0.4% 台盼蓝染液，在装有 20 倍物镜的显微镜下观察溶液。裂解的细胞吸收染液，被染成蓝色，而完整的细胞不被染色，仍然是透明的。继续进行组织匀浆直到大于 80%~90% 的细胞已经破碎。 C. 匀浆物用冰冷的组织匀浆缓冲液稀释到 85 ml。在晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管中放入 10 ml 冰冷的组织匀浆缓冲液，取 27 ml 稀释的匀浆物铺在上面。以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min）在 4°C 离心 40 min。 d. 去掉上清，离心管倒置 1~2 min 使溶液流干。然后把离心管放在冰上。 (可选）用剃须刀刀片切掉管子上部 2/3, 把带有细胞核的余下 1/3 放在冰上。 e. 用 2 ml 冰冷的组织重悬缓冲液重悬细胞核沉淀。精确测量重悬细胞核溶液的体积，加入冰冷的 5mol/LNaCl，使终浓度为 300 mmol/L。轻轻混匀悬浮液，然后冰浴 30 min。 f. 以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min）在 4°C 离心 20 min 回收细胞核。小心地把上清转移到新鲜管中。上清分装成 100~200ul 的小份。留下一份用来做蛋白浓度测定。其他的用液氮速冻，并贮存在液氮中。 g. 用 Bradford 法测定上清液的蛋白浓度。 从培养细胞中制备核提取物 a. 从培养瓶、培养血或培养孔中收获 0.5X108~1X108 细胞。在室溫下以 250 g(用 Sorvall Hl000B 转头是1100r/min) 离心收集细胞。用不含 Ca2+的磷酸盐缓冲液洗细胞若干次。 b. 用 5 倍体积冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的细胞匀浆缓冲液重悬细胞沉淀。冰浴 10 min，然后如前离心收集。 c. 用 3 倍体积冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的细胞匀浆缓冲液重悬细胞沉淀，用带有紧型研杵的 Dounce 匀浆器击打 20 次使细胞匀浆。在细胞胀大裂解并释放出完整细胞核的匀浆过程中，匀浆器要埋在冰里。 d. 在 4°C 以 250 g(用 Sorvall H1000B 转头是 1100r/min) 离心收集细胞核，去掉上清，用 1ml 细胞重悬缓冲液重悬细胞核沉淀。精确测量重悬细胞核溶液的体积，加人冰冷的 5 ml/LNaCl, 使终浓度为 300 mmol/L。轻轻混匀悬浮液，然后冰浴 30 min。 e. 以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min) 在 4°C 离心 20 min 回收细胞核。小心地把上清转移到一个预冷的新鲜管中。上清分装成 100~200ul 的小份。留下一份用来做蛋白浓度测定。其他的用液氮速冻，并贮存在液氮中。用 Bradford 法测定上淸液的蛋白浓度。 从小量培养细胞中制备核抽提物 本方法适用于转染有质粒的细胞，这些质粒能表达编码转录因子的 cDNA。 a. 细胞用细胞淋洗缓冲液洗若干次。每个培养皿加入1ml 细胞淋洗缓冲液，用橡胶棒把细胞刮到缓冲液中。 b. 细胞悬液转移到 1.5 ml 离心管中，室温下用最大速度离心 2 min 沉淀细胞。 c. 对于原来在每个直径为 150 mm 的培养皿中培养的细胞，加 300ul 细胞重悬液重悬细胞，然后进行 3 次冻融。 d. 在 4°C 以最大速度离心 5 min 去掉细胞碎片。上清（即细胞裂解物）分装成小份贮存在-70°C。 2. 在 1.5 ml 离心管中加入： 核提取物或蛋白组分 1~23ul 32P 末端标记的 DNA 1~10fmol 1 mg/ml poly(dI-dC) 1ul H2O 加到 25ul 可选择加入： 20%Ficoll 400 12ul 或 10% 聚乙烯醇 10ul 在 4°C 大约离心 5s, 使反应液都流到管底。冰浴 10~30 min。  3. 室温下加入 50ul MgCl2/CaCl2 溶液并轻轻混匀。室温下放置 1 min。加入 1~8 稀释的 DNA 酶 I 溶液，轻轻混匀并在室温下放置 1 min。 4. 加 75ul 终止液终止反应。很快地摇匀后，用相同体积的酚/氯仿抽提反应液。 5. 把液相转移到新离心管中，用 2.5 倍体积乙醇沉淀核酸。该乙醇溶液在-70°C 放置 15 min, 然后在 4°C 用最大速度离心 10 min 收集沉淀。用 1 ml 70% 乙醇洗沉淀，再次离心，然后在空气中干燥以去除残存的乙醇。 6. 加入 5~10ul 甲醛染液，剧烈振荡使 DNA 沉淀溶解。煮 3~5 min 使 DNA 溶液变性。 7. 准备 6% 或 8% 变性的聚丙烯酰胺测序胶，加样前进行至少 30 min 的预电泳。 8. 按以下次序加入 DNA 样品： 序列梯带 不含核提取物情况下用 DNA 酶 I 消化后的对照 DNA 含有核提取物情况下用 DNA 酶 I 消化后的靶 DNA 含有核提取物但不含有 DNA 酶 I 情况下培养后的靶 DNA 9. 用足够的恒定功率跑胶，温度维持在 45~50°C。 使感兴趣的序列获得最佳分辨率的跑胶时间要根据经验确定。从甲醛凝胶上样缓冲液中染料的迁移率观察电泳的进程。 10. 电泳结束后，撬开玻璃板，把胶转移到一块厚的杂交纸上。真空干燥凝胶大约 1h, 然后用 X 射线胶片曝光，如果不用增感屏，需要在-20°C 曝光 12~16 h。此外, 干的凝胶也可以用磷屏图像分析（phosphorimage analysis), 大约 1~3 h。    |
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