λ噬菌体 DNA 或Φ174DNA 用 Alu I[1ug Alu I, 溶于 20ul TE(pH7.6)]完全酶解]。 酶解后,用等体积酚: 氯仿抽提 DNA, 去除限制性内切核苷酶。乙醇沉淀 DNA 重溶于 TE(PH7.6) 中,按步骤 13 測试酶解 DNA 与去磷酸化、线性化栽体的连接效率。如采使用商品化的栽体就不需要消化 DNA 了。
DNA 分子质量标准 适当大小的 DNA 分子质量标准,如 Life Technologies 公司用 Sau3AI 消化的 PUC18pUC19DNA, 或相差 123bp 的梯度分子质量标准;New England Biolabs 用 Hae Ⅲ消化的ΦX174 DNA。
dNTP 溶液,含有 4 种 dNTP, 每种浓度为 2.0 mmol/L
靶 DNA 靶 DNA 制备通常由用限制酶消化高容量栽体(如:黏粒栽体、BAC、PAC 或 P1) 构建的重组体获得。所用限制酶的酶切位点应在克隆片段的序列中不存在。如果可能尽量使用能产生黏性末端的限制性酶,这可以简化纯化的粑 DNA 的连接(步骤 1)。靶 DNA 片段从载体中酶切下来后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化(请参见第 5 章的方案 6 或 7)。用 TE(pH7.6) 溶解纯化的 DNA,浓度为取 DNA 溶液(50ng),用琼脂糖凝胶电泳检査 DNA 的完整性和回收率。
a. 在超声仪的角杯中注满冰水,打开超声仪开关. 设置好时间,功率设为 10, 用两次 40 秒脉冲预热超声仪。 冰水可以防止 DNA 变性,超声不同样品前最好更换角杯中的冰水。
b. 将装有 DNA 的离心管放置于冰水中,离心管的底部恰好高于角杯探头中心孔 1~2 mm,超声处理 DNA(参见图 12-3)。 通过超声处理试验样品 DNA, 并用步骤 4 描述的方法分析超声结果,确定最适超声处理条件。对于大多数 DNA 样品,功率设为 3, 两次 6 秒脉冲主要产生 500~2000bp 大小的片段。
c. 快速离心使超声处理的 DNA 溶液沉积于离心管底部,并置于冰上。
d. 取 lul 超声处理的 DNA 样品和适当大小的 DNA 分子质量标准,用 0.7% 琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 片段大小。电泳时余下的 DNA 样品仍放置在冰上。 如果得到的 DNA 片段大小不合适,改变超声条件,再次进行超声处理。如果得到的 DNA 片段大小合适,继续按步骤 5 所述进行 DMA 末端修补。
喷雾断裂 DNA(请参见图 12-4)
a. 准备如下 DNA 溶液,并置于喷雾杯中。
DNA 样品(来源于步骤 3 ) 5~10ug 10XTM 缓冲液(pH8.0) 200ul 无菌 100% 甘油 1 ml 无菌水 至终体积为 2 ml
b. 将 DNA 样品置于冰浴中,依据经验用最适条件喷雾处理 DNA 样品。 DNA 片段的大小主要决定于氮气的压力。例如,8psi(0.56 kg/cm2) 压力处理黏粒栽体 DNA 主要产生 1000~2500bp 大小的片段。对一个新的靶 DNA 的最适喷雾压力和喷雾时间要依据经验确定。同超声处理-样,冰水浴可以防止 DNA 降解,同时对产生大小均匀的 DNA 片段有重要作用。
C. 将喷雾器置于合适的离心机转头中,用聚苯乙烯泡沫塑料做衬蛰。于 4°C 2000 g(配备微孔板放置装置的离心机用 1000r/min) 快速离心使样品 DNA 溶液沉积于喷雾杯的底部。
d. 将 DNA 样品溶液分成四份,转入 1.5 ml 离心管中,按标准方法乙醇沉淀 DNA, 真空干燥 DNA 沉淀。
e. 用 35ul TE(pH7.6) 溶解每一份 DNA 沉淀,取 1ul 喷雾处理的 DNA 样品和适当分子质量大小的 DNA 分子质量标准,用 0.7% 琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 片段大小。电泳时余下的 DNA 样品 4°C 保存。 如果得到的 DMA 片段大小不合适,改变喷雾条件,再次进行喷雾处理。如果得到的 DNA 片段大小合适,继续按步骤 5 所述进行 DNA 末端修补。
DNA 的修补、磷酸化和大小选择
喷雾处理和超声处理产生的 DMA 末端是高度不均一的,包括平末端和残损末端、带有磷酸基团和不带磷酸基团的末端。因为在这些分子中只有一部分能被 DNA 聚合酶修补,流体静力剪切的 DNA 克隆到 M13 噬菌体上的效率通常较低。不过超声处理 5~10ug 靶 DNA, 经过修补和选择大小适当的片段,一般能形成几千个重组克隆。
按第3章的方案2 所述方法挑取单一无色噬菌斑,接种在含有 2 ml 细菌培养基的 15 ml 试管中进行培养。然后分别回收备重组病毒颗粒,纯化 DNA(参见第3章的方案 3 和 4)。由于每次只能处理 12 或 24 个克隆,模板纯化过程费时且繁琐。大规模的 DNA 测序需要成千上万的 DNA 模板,但采用有机溶剂抽提和多步离心方法不能快速、经济地制备单链 DNA 模板。取而代之的 M13 噬菌体模板大量制备方法通常包括噬菌体颗粒的纯化或结合自动化技术设备(e.g.,please see Mardis and Roe1989;Smith et al.1990) 用过滤法(Eperon1996)、磁珠法(Alderton et al.1992;Wahlberg et al.1992;Hawkins et al.1994) 或顺磁球法(Fryetal.1992;Wilson1993) 纯化单链 DNA。但是这些设备和操作设备所需的工作人员是一般的学术机构所不具备的。不过 Zollo 和 Chen(1994) 报告了一种用于在 96 孔板中培养 M13 噬菌体克隆,并制备单链 DNA 的有效的可重复的方法,满足了基于荧光的自动化 DNA 测序仪对大量模板的需求。
在鸟枪法测序中,使用一次性平底孔板或一次性试管组盒,以少 M 细菌培养物培养 M13 噬菌体重组子,同时处理 96 个样品是非常有效的。所有单链 DNA 模板制备有关的后续步骤都可以在同一块板中进行,减少了一步又一步转移克隆的工作量,使一个研究人员可在一天内制备 960 个或更多的DNA模板(Pleasesee Zollo and Chen1994)。